固相萃取與固相微萃取
固相萃取(Solid?Phase?Extraction??SPE)就是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。??
與液－液萃取相比固相萃取有很多優(yōu)點(diǎn)：固相萃取不需要大量互不相溶的溶劑，處理過程中不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，它采用高效﹑高選擇性的吸附劑（固定相），能顯著減少溶劑的用量，簡化樣品于處理過程，同時所需費(fèi)用也有所減少。一般說來固相萃取所需時間為液－液萃取的1/2，費(fèi)用為液－液萃取的1/5。其缺點(diǎn)是：目標(biāo)化合物的回收率和精密度要低于液－液萃取。
一．?固相萃取的模式及原理
固相萃取實質(zhì)上是一種液相色譜分離，其主要分離模式也與液相色譜相同，可分為正相（吸附劑極性大于洗脫液極性），反相（吸附劑極性小于洗脫液極性），離子交換和吸附。固相萃取所用的吸附劑也與液相色譜常用的固定相相同，只是在粒度上有所區(qū)別。
正相固相萃取所用的吸附劑都是極性的，用來萃?。ūＡ簦O性物質(zhì)。在正相萃取時目標(biāo)化合物如何保留在吸附劑上，取決于目標(biāo)化合物的極性官能團(tuán)與吸附劑表面的極性官能團(tuán)之間相互作用，其中包括了氫鍵，π—π鍵相互作用，偶極－偶極相互作用和偶極－誘導(dǎo)偶極相互作用以及其他的極性－極性作用。正相固相萃取可以從非極性溶劑樣品中吸附極性化合物。
反相固相萃取所用的吸附劑通常是非極性的或極性較弱的，所萃取的目標(biāo)化合物通常是中等極性到非極性化合物。目標(biāo)化合物與吸附劑間的作用是疏水性相互作用，主要是非極性－非極性相互作用，是范德華力或色散力。
離子交換固相萃取所用的吸附劑是帶有電荷的離子交換樹脂，所萃取的目標(biāo)化合物是帶有電荷的化合物，目標(biāo)化合物與吸附劑之間的相互作用是靜電吸引力。
固相萃取中吸附劑（固定相）的選擇主要是根據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)和樣品基體（即樣品的溶劑）性質(zhì)。目標(biāo)化合物的極性與吸附劑的極性非常相似的時，可以得到目標(biāo)化合物的最佳保留（最佳吸附）。兩者極性越相似，保留越好（即吸附越好），所以要盡量選擇與目標(biāo)化合物極性相似的吸附劑。例如：萃取碳?xì)浠衔铮ǚ菢O性）時，要采用反相固相萃?。ù藭r是非極性吸附劑）。當(dāng)目標(biāo)化合物極性適中時，正﹑反相固相萃取都可使用。吸附劑的選擇還要受樣品的溶劑強(qiáng)度（即洗脫強(qiáng)度）的制約。
樣品溶劑的強(qiáng)度相對該吸附劑應(yīng)該是較弱的，弱溶劑會增強(qiáng)目標(biāo)化合物在吸附劑上的保留（吸附）。溶劑強(qiáng)度在正﹑反固相萃取中的順序是不同的（見圖3—13）。如果樣品溶劑的強(qiáng)度太強(qiáng)，目標(biāo)化合物將得不到保留（吸附）或保留很弱。例如：樣品溶劑是正己烷時用反相固相萃取就不合適了，因為正己烷對反相固相萃取是強(qiáng)溶劑（見圖3—13），目標(biāo)化合物將不會吸附在吸附劑上；當(dāng)樣品溶劑是水時就可以用反相固相萃取，因為水對反相固相萃取是弱溶劑，不會影響目標(biāo)化合物在吸附劑上的吸附。
固相萃取選擇分離模式和吸附劑時還要考慮以下幾點(diǎn)：
?目標(biāo)化合物在極性或非極性溶劑中的溶解度，這主要涉及淋洗液的選擇。
2.?目標(biāo)化合物有無可能離子化（可用調(diào)節(jié)pH?值實現(xiàn)離子化），從而決定是否采用離子交換固相萃取。
3.?目標(biāo)化合物有無可能與吸附劑形成共價鍵，如形成共價鍵，在洗脫時可能會遇到麻煩。
4.?非目標(biāo)化合物與目標(biāo)化合物在吸附劑上吸附點(diǎn)上的競爭程度，這關(guān)系到目標(biāo)化合物與干擾化合物是否能很好分離。
二．?固相萃取常用的吸附劑（固定相）
鑒于固相萃取實質(zhì)上是一種液相色譜的分離，故原則上講，可作為液相色譜柱填料的材料都可用于固相萃取。但是，由于液相色譜的柱壓可以較高，要求柱效較高，故其填料的粒度要求較嚴(yán)格，過去常用10μm粒徑填料，現(xiàn)在高效柱多用5μ的m填料，甚至用了3μm的填料（隨著HPLC泵壓的提高，填料的粒徑在逐漸減?。?。對填料的粒徑分布要求也很窄。固相萃取柱上所加壓一般都不大，分離目的只是把目標(biāo)化合物與干擾化合物和基體分開即可，柱效要求一般不高，故作為固相萃取吸附劑的填料都較粗，一般在40μm即可用，粒徑分布要求也不嚴(yán)格，這樣可以大大降低固相萃取柱的成本。常用于固相萃取的吸附劑類型及用途參見表3—4。
三．?固相萃取的裝置及操作程序
最簡單的固相萃取裝置就是一根直徑為數(shù)毫米的小柱（圖3—14），小柱可以是玻璃的，也可以是聚丙稀﹑聚乙烯﹑聚四氟乙烯等塑料的，還可以是不銹鋼制成的。小柱下端有一孔徑為20μm的燒結(jié)篩板，用以支撐吸附劑。如自制固相萃取小柱沒有合適的燒結(jié)篩板時，也可以用填加玻璃棉來代替篩板，起到既能支撐固體吸附劑，又能讓液體流過的作用。在篩板上填裝一定量的吸附劑（100㎎~1000㎎，視需要而定），然后在吸附劑上再加一塊篩板，以防止加樣品時破壞柱床（沒有篩板時也可以用玻璃棉替代）。目前已有各種規(guī)格的﹑裝有各種吸附劑的固相萃取小柱出售，使用起來十分方便（圖3—15）。
固相萃取的一般操作程序如下：
1．活化吸附劑：在萃取樣品之前要用適當(dāng)?shù)娜軇┝芟垂滔噍腿⌒≈?，以使吸附劑保持濕潤，可以吸附目?biāo)化合物或干擾化合物。不同模式固相萃取小柱活化用溶劑不同：
（1）反相固相萃取所用的弱極性或非極性吸附劑，通常用水溶性有機(jī)溶劑，如甲醇淋洗，然后用水或緩沖溶液淋洗。也可以在用甲醇淋洗之前先用強(qiáng)溶劑（如己烷）淋洗，以消除吸附劑上吸附的雜質(zhì)及其對目標(biāo)化合物的干擾。
（2）正相固相萃取所用的極性吸附劑，通常用目標(biāo)化合物所在的有機(jī)溶劑（樣品基體）進(jìn)行淋洗。
（3）離子交換固相萃取所用的吸附劑，在用于非極性有機(jī)溶劑中的樣品時，可用樣品溶劑來淋洗；在用于極性溶劑中的樣品時，可用水溶性有機(jī)溶劑淋洗后，再用適當(dāng)PH?值的﹑并含有一定有機(jī)溶劑和鹽的水溶液進(jìn)行淋洗。
為了使固相萃取小柱中的吸附劑在活化后到樣品加入前能保持濕潤，應(yīng)在活化處理后在吸附劑上面保持大約1ml活化處理用的溶劑。
2．上樣：將液態(tài)或溶解后的固態(tài)樣品倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空（圖3—16），加壓（圖3—17）或離心（圖3—18）的方法使樣品進(jìn)入吸附劑。??
3．?洗滌和洗脫：在樣品進(jìn)入吸附劑，目標(biāo)化合物被吸附后，可先用較弱的溶劑將弱保留干擾化合物洗掉，然后再用較強(qiáng)的溶劑將目標(biāo)化合物洗脫下來，加以收集。淋洗和洗脫同前所述一樣，可采用抽真空，加壓或離心的方法使淋洗液或洗脫液流過吸附劑。
如果在選擇吸附劑時，選擇對目標(biāo)化合物吸附很弱或不吸附，而對干擾化合物有較強(qiáng)吸附的吸附劑時，也可讓目標(biāo)化合物先淋洗下來加以收集，而使干擾化合物保留（吸附）在吸附劑上，兩者得到分離。圖3—19給出了兩種方法的示意圖。在多數(shù)的情況下是使目標(biāo)化合物保留在吸附劑上，最后用強(qiáng)溶劑洗脫，這樣更有利于樣品的凈化。圖3—20給出了固相萃取
所采用的一般程序示意圖。
為了方便固相萃取的使用，很多廠家除了生產(chǎn)各種規(guī)格和型號的固相萃取小柱之外，還研制開發(fā)了很多固相萃取的專用裝置，使固相萃取使用起來更加方便簡單。如Supelco公司提供了給單個固相萃取小柱加壓的單管處理塞（圖3—21），可方便的與固相萃取小柱配套使用。又如，為了能使多個固相萃取小柱同時進(jìn)行抽真空，Supelco公司提供了12孔徑和24孔徑的真空多歧管裝置（圖3—22），可同時處理多個固相萃取小柱。我國中科院大連化學(xué)物理研究所，國家色譜研究分析中心也研制開發(fā)了真空固相萃取裝置。
四．?固相微萃取(Solid?phase?Micro-Extraction??SPME)
固相微萃取是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的萃取分離技術(shù)，與液—液萃取和固相萃取相比，具有操作時間短，樣品量小，無需萃取溶劑，適于分析揮發(fā)性與非揮發(fā)性物質(zhì)，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。很多研究結(jié)果表明，在樣品中加入適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析時，其重現(xiàn)性和精密度都非常好。固相微萃取裝置外型如一只微量進(jìn)樣器，由手柄（holder）和萃取頭或纖維頭（fiber）兩部分構(gòu)成，萃取頭是一根1㎝長，涂有不同吸附劑的熔融纖維，接在不銹鋼絲上，外套細(xì)不銹鋼管（保護(hù)石英纖維不被折斷），纖維頭在鋼管內(nèi)可伸縮或進(jìn)出，細(xì)不銹鋼管可穿透橡膠或塑料墊片進(jìn)行取樣或進(jìn)樣。手柄用于安裝或固定萃取頭，可永遠(yuǎn)使用（圖3—24）
固相微萃取關(guān)鍵在于選擇不石英纖維上的涂層（吸附劑），要使目標(biāo)化合物能吸附在涂層上，而干擾化合物和溶劑不吸附，一般是：目標(biāo)化合物是非極性時選擇非極性涂層；目標(biāo)化合物是極性時選擇極性涂層。
固相微萃取的采樣方法是將固相微萃取針管（不銹鋼套管）穿過樣品瓶密封墊，插入樣品瓶中。然后推出萃取頭，將萃取頭浸入樣品（浸入方式）或置于樣品上部空間（頂空方式），進(jìn)行萃取。萃取時間大約2—30分鐘，以達(dá)到目標(biāo)化合物吸附平衡為準(zhǔn)。最后縮回萃取頭，將針管拔出（圖3—25）。
固相微萃取可用于氣相色譜，也可用于液相色譜（圖3—25）。用于GC時，是將固相微萃取針管（不銹鋼套管）插入GC進(jìn)樣口，推手柄桿，伸出纖維頭，使用進(jìn)樣口的高溫?zé)峤馕繕?biāo)化合物，解吸后被載氣帶入色譜柱。用于HPLC時，是將固相微萃取針管（不銹鋼套管）插入固相微萃取/HPLC接口解吸池，然后再利用HPLC的流動相通過解吸池洗脫目標(biāo)化合物，并將目標(biāo)化合物帶入色譜柱。
五．?固相萃取的應(yīng)用
固相萃取主要用于復(fù)雜樣品中微量或痕量目標(biāo)化合物的分離和富集。例如，生物體液（如血液，尿等）中藥物及其代謝產(chǎn)物的分析，食品中有效成分或有害成分的分析，環(huán)保水樣中各種污染物（可揮發(fā)性有機(jī)物和半揮發(fā)性有機(jī)物）的分析都可使用固相萃取將目標(biāo)化合物分離出來，并加以富集，然后進(jìn)行色譜分析。下面舉兩個具體分析實例加以說明。
1．?血漿中苯并二氮雜草類藥物（安定）的測定
使用6ml的固相萃取柱，柱內(nèi)填加500㎎C18吸附劑。用5ml甲醇活化，然后再用5ml水淋洗。將1ml?0.1M醋酸鈉加入4ml血漿中，充分混合后倒入萃取柱內(nèi)，抽濾。然后加入3ml水，抽濾30秒。再將固相萃取柱在1000~1500rpm離心機(jī)上離心5分鐘。用3ml丙酮洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在氮?dú)饬飨戮従徏訜幔?lt;45℃）至干燥。用200μl甲醇溶解殘渣，進(jìn)樣20μl，進(jìn)行HPLC分析。
HPLC條件：
柱子:?ODS-3???5μm??150×4.6mm
流動相:乙腈/甲醇/5mMKH2PO4(15/30/55）
流速:?2ml/min
柱溫:?40℃
檢測器:?UV254
2．?水中多環(huán)芳烴（PAHS）的測定
使用6ml固相萃取柱，柱內(nèi)填加500mgC18吸附劑，用5ml二氯甲烷活化,?然后再用5ml甲醇和5ml水重復(fù)一次。加2ml異丙醇到20ml水樣中（10%異丙醇含量），?混合后倒入固相萃取柱，流速不得大于10ml/min。用3ml甲醇/水（50/50）淋洗，抽真空30秒，再將固相萃取柱在1000~1500rpm離心機(jī)上離心5分鐘。用3ml二氯甲烷洗脫，收集洗脫液。將洗脫液在干燥氮?dú)饬飨聺饪s到50~200μl，濃縮時樣品不要加熱，以免造成小分子多環(huán)芳烴的丟失。加二氯甲烷至總體積為200μl，進(jìn)樣20μl，進(jìn)行GC分析。
GC條件：?柱DB-5???30m×0.25mmID??0.25μ????載氣：氮?dú)??線速度為35cm/秒?(65℃)
程序升溫：65℃停留1分鐘后以25℃/分的升溫速率升至140℃，然后以10℃/分的升溫速
率升至290℃，在290℃停留25分鐘。進(jìn)樣：275℃??不分流進(jìn)樣，吹掃45秒
檢測器：FID??300℃???尾吹氮?dú)?0ml/分?????實驗結(jié)果見圖3—27和表3—6
