圖1.? 與細胞內蛋白表達相比，無細胞蛋白表達系統(tǒng)能夠顯著地節(jié)約時間。

與基于細胞的蛋白表達系統(tǒng)相比較，無細胞蛋白表達系統(tǒng)具有獨特的優(yōu)勢，包括節(jié)約時間、提高具有功能的、可溶的、全長蛋白的總體產量。本文介紹了根據模板類型、期望產率以及下游實驗等因素來選擇無細胞蛋白表達系統(tǒng)的標準。

與基于細胞的蛋白表達系統(tǒng)相比較，無細胞蛋白表達系統(tǒng)具有獨特的優(yōu)勢，包括節(jié)約時間、提高具有功能的、可溶的、全長蛋白的總體產量。此外，無細胞蛋白表達系統(tǒng)更適用于激酶等毒性蛋白的表達、也可使用經過修飾的tRNA來進行標記，在某特定位點摻入非天然的氨基酸。同時，這些系統(tǒng)還可以用于高通量實驗。選擇一個無細胞蛋白表達系統(tǒng)，最主要的幾點考慮因素包括細胞提取物或裂解物的來源、模板以及期望的蛋白產量。本文介紹的信息可幫助研究者選擇適合其實驗體系和下游應用的無細胞蛋白表達系統(tǒng)。

考慮因素之模板

在使用插入片斷或載體進行真核細胞系統(tǒng)蛋白表達時，有以下幾個因素需要考慮：（i）ATG起始密碼子應該是位于轉錄起始位點下游的第一個ATG密碼子；（ii）理想化而言，在啟動子之后，ATG應該包含在Kozak共有序列之內；（iii）在模板序列的3'端應包含終止密碼子；（iv）終止密碼子之后應帶有合成的多聚A尾。此外，使用TNT T7麥胚偶聯(lián)系統(tǒng)（TNT T7 CoupledWheat Germ System）時，載體還應包含一個T7終止子序列或該載體呈線性化。在原核系統(tǒng)中，起始密碼子的選擇幾乎無一例外地依賴于核糖體結合位點（ribosomal binding site, RBS）的存在，這個位點包含了閱讀框架的起始信號。經過優(yōu)化的核糖體結合位點能夠大大提高原核細胞內蛋白的表達。原核系統(tǒng)不識別位于ATG起始密碼子上游的任何ATG，除非這些ATG含有一個處于合適位置的核糖體結合位點。使用兔網織紅細胞裂解物（RABBit ReticulocyteLysate, RRL）時，DNA介導的蛋白合成與mRNA為起始的蛋白合成相比較，具有以下優(yōu)點：當進行高水平的蛋白合成時，不需要處理mRNA的繁雜操作過程。

圖2.? TNT兔網織紅細胞裂解物轉錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)以質粒為模板，在一個試管內完成轉錄和翻譯；TNT PCR DNA快速系統(tǒng)對于PCR模板效果良好。

基于真核細胞RNA的翻譯

在1950至1960年間，研究人員證實了兔網織紅細胞裂解物可以經過人為操作，用于外源mRNA介導的蛋白合成，這樣可以只把感興趣的蛋白合成出來。經過核酸酶處理的兔網織紅細胞裂解物和Flexi兔網織紅細胞裂解物均增加了一些添加劑，為mRNA的翻譯過程進行了優(yōu)化。這些添加劑包括氯高鐵血紅素—用于防止亞鐵血紅素調節(jié)的elF-2α激酶（HRI）的激活作用；能量生成系統(tǒng)，含有經過測試的磷酸肌酸激酶和磷酸肌酸；以及小牛肝臟tRNA用于平衡消耗的tRNA種類，這樣可以優(yōu)化密碼子的使用，并擴大可被高效率翻譯的mRNA的范圍。與經過核酸酶處理的兔網織紅細胞裂解物相比較，Flexi兔網織紅細胞裂解物系統(tǒng)可提供更強的靈活性，能夠將翻譯反應的很多參數進行優(yōu)化，這些參數包括Mg2+濃度、K+濃度，以及DTT的存在與否。

麥胚提取物（Wheat Germ Extract, WGE）含有合成蛋白所需要的細胞組分（tRNA、核糖體、起始因子、延長因子以及終止因子）。該提取物系統(tǒng)做了進一步優(yōu)化：添加了由磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶組成的能量生成系統(tǒng)；添加了亞精胺，用于加強蛋白鏈延長的效率，以防止蛋白鏈的終止過早地發(fā)生；添加了醋酸鎂，并使其濃度適合大多數種系mRNA的翻譯。

最后，還單獨提供了醋酸鉀，以用于優(yōu)化更多種類的mRNA。

圖3.? Coomassie染色的SDS PAGE。使用TNT SP6 高產率提取物系統(tǒng)以透析模式表達蛋白，反應體系為100μl，質粒模板8μg，提取物60μl。反應體系置于透析杯（MWCO 12000 BioTec International, 經銷-DaiichiPure Chemicals DBC Code 212956）內，Uniplate（Whatman）中含有2.5ml透析緩沖液，于25℃孵育18h。透析緩沖液含有12 mM HEPES、0.5mM亞精胺、5 mM DTT、80μM氨基酸、70mM KOAc、1.7mMATP、0.6mM GTP、0.6mM CTP、6 mM UTP、20mM CP和3.5mMMg（OAc）2。泳道1：螢火蟲螢光素酶，MW 62 KDa；泳道2：MonsterGreen GFP，MW 28 KDa；泳道3：人源化的海腎螢光素酶，MW 36KDa。

麥胚提取物適用于表達小分子的蛋白，或用于表達富含于兔網織紅細胞裂解物中的蛋白。當RNA制備物中含有少量的dsRNA或硫醇時，該系統(tǒng)也很適用，上述這些物質具有抑制翻譯的作用。在表達植物蛋白、酵母蛋白或其它真菌蛋白時，研究人員也會發(fā)現麥胚提取物比兔網織紅細胞裂解物更合適。

基于真核細胞DNA的轉錄和翻譯

20世紀90年代，偶聯(lián)的轉錄/翻譯（即TNT）系統(tǒng)被開發(fā)出來，該系統(tǒng)包含兔網織紅細胞裂解物或麥胚提取物，并帶有T7、T3或SP6 RNA聚合酶，這些系統(tǒng)使基于DNA的蛋白合成成為現實。TNT兔網織紅細胞裂解物轉錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)和TNT快速轉錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)僅需一個試管，即能夠以質粒為模板轉錄和翻譯蛋白（圖2）。常規(guī)的TNT偶聯(lián)系統(tǒng)中的不同組分以單獨包裝提供，包括三種氨基酸混合物：甲硫氨酸缺失的混合物、半胱氨酸缺失的混合物或亮氨酸缺失的混合物。TNT快速偶聯(lián)系統(tǒng)提供一個混合母液，包含所有的反應組分（包括甲硫氨酸缺失的氨基酸混合物），減少了加樣步驟，節(jié)約了時間。TNT T7 PCR DNA快速系統(tǒng)是為PCR反應產生的線性DNA模板而特別設計，這樣的模板比質粒DNA模板往往要求更高的鉀離子和鎂離子濃度。

對于真核細胞轉錄/翻譯偶聯(lián)反應，除兔網織紅細胞裂解物之外，TNT麥胚提取物系統(tǒng)（TNT CoupledWheat Germ Extract Systems）是又一個選擇，后者也是單個試管的反應模式。普通的麥胚提取物通常是利用SP6, T3或T7 RNA聚合酶啟動子在體外合成RNA，然后再進行翻譯反應。與此不同的是，TNT麥胚提取物系統(tǒng)將轉錄反應直接整合到翻譯反應混合物中。

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Promega無細胞表達系統(tǒng)比較表：模板、應用及產率模板應用產率

基于原核細胞DNA的轉錄和翻譯

E.coli S30提取物系統(tǒng)（E.coli S30 ExtractSystems）是從E.col i B菌株制備而來，該菌株中omp T 胞內蛋白酶和lon蛋白酶活性缺失。這種缺失能夠大大提高被表達蛋白的穩(wěn)定性，否則，在細胞內表達的蛋白會被蛋白酶所降解。E.coli S30提取物系統(tǒng)能夠表達更多量的蛋白，這些蛋白在細胞內表達時，由于宿主編碼的抑制劑的激活，這些蛋白的表達量很低。E. coli S30提取物的DNA模板可以是線性的，也可以是環(huán)狀的。線性DNA為模板的S30提取物（E.coli S30 Extract System for Linear Templates,Cat.# L1030）是從E.coli B菌株中制備的，該菌株核酸外切酶V（recBCD enzyme）缺失。以線性DNA為模板的S30提取物比以環(huán)狀DNA為模板的S30提取物（E.coli S30 Extract System for Circular DNA, Cat.#L1020）和T7 S30提取物（E. coli T7 S30 Extract System for Circular DNA, Cat.# L1130）的活性低。在使用這些系統(tǒng)時，研究人員僅需準備帶有適當的原核細胞啟動子和核糖體結合位點的克隆DNA即可。

以環(huán)狀DNA為模板的E. coli T7 S30提取物系統(tǒng)（Cat.# L1130）簡化了克隆在質?；騆ambda載體上的DNA序列的轉錄/翻譯反應，該提取物中包含用于轉錄的T7 RNA聚合酶，以及翻譯反應所需的所有必備組分。研究人員僅需提供帶有T7啟動子和核糖體結合位點的克隆DNA。

考慮因素之蛋白產量

對于大多數體外表達系統(tǒng)而言，每50ml反應體系可產生皮摩爾級或納克級的蛋白量。通常，該產量足夠用于大多數的蛋白放射性分析、熒光分析以及抗體分析，例如聚丙烯酰胺凝膠分離、Western blotting、免疫沉淀；或者，也可進行酶學或生物活性的檢測，這取決于目的蛋白的特性。如果是放射性檢測，應在翻譯反應體系中加入同位素標記的氨基酸，翻譯反應結束后，可使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）結合放射性自顯影來檢測目的蛋白。或者，也可使用非放射性標記方法，如熒光法、化學發(fā)光法或比色法。

如果擁有現成的目的蛋白的抗體，也可以使用免疫雜交或免疫沉淀的方法來進行檢測。通常，從體外翻譯反應得到的蛋白，其功能活性可在翻譯反應混合物中直接進行檢測。如果有必要純化蛋白，可將目的蛋白與純化標簽融合，使目的蛋白便于從體外翻譯反應體系中純化出來，然后可進行進一步研究。

高產率的無細胞蛋白合成

如前所述，大多數無細胞表達系統(tǒng)所產生的蛋白量是有限的。用于表達真核細胞蛋白的麥胚提取物經過進一步修飾，能夠提高蛋白表達量，可用于多種功能和結構蛋白質組學研究。SP6 TNT高產率系統(tǒng)（TNT SP6 High-Yield Wheat Germ Protein ExpressionSystem, Cat.# L3260, L3261）使用高產率提取物，補充了SP6 RNA聚合酶以及其它組分。分批模式下，該系統(tǒng)可合成的蛋白量是100 mg/ml，使用透析模式時，可得到200~400mg/ml的蛋白（圖3）。此外，可不經過蛋白純化，即可在反應體系內直接進行酶活性的檢測。通過親和標簽，可完成簡便的純化，僅需一步即告完成。也可經過微小的修改，在該體系內實現對目的蛋白的標記。

總結

無細胞表達系統(tǒng)能夠幫助你完成蛋白的快速表達，產量足夠用于下游實驗。與細胞內表達相比，這些系統(tǒng)對毒蛋白的敏感度低；結合應用某些附加組分，如微粒體膜，可表達正確折疊的蛋白以及經過修飾的膜蛋白；同時，這些系統(tǒng)還可以在目的蛋白上摻入標記物或用于純化的標簽。