1. 簡 介?
????? 膀胱癌是泌尿系最常見的惡性腫瘤，在我國每年有約15萬的膀胱癌新發(fā)病例，而且發(fā)病率呈逐年增高之勢(shì)。由于全部尿路從腎盞、腎盂、輸尿管、膀胱及前列腺和尿道均為移行上皮所覆蓋，所以90 %以上是移行細(xì)胞癌(Transitional Cell Carcinoma, TCC)，少數(shù)為鱗癌和腺癌。移行細(xì)胞癌患者中近30％初診時(shí)已有肌層浸潤，其余70％為淺表性膀胱癌；雖采用經(jīng)尿道切除和膀胱腔內(nèi)輔助治療可獲得良好效果，但復(fù)發(fā)率高達(dá)50％～70％，而且10％～15％的復(fù)發(fā)腫瘤侵及肌層，有時(shí)復(fù)發(fā)會(huì)在術(shù)后數(shù)年發(fā)生。因此，早期診斷和長期復(fù)查監(jiān)測(cè)非常必要[1]。?

膀胱癌診斷和篩查的主要手段是膀胱鏡下活檢和尿細(xì)胞學(xué)檢查。雖然膀胱鏡是診斷復(fù)發(fā)性尿路上皮癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但是具有侵入性，且對(duì)于微小病變和原位癌不易辨認(rèn)。尿脫落細(xì)胞病理學(xué)檢查雖然無創(chuàng)傷，然而陽性率僅為8 %～46 %，尤其在檢測(cè)低級(jí)別腫瘤時(shí)敏感度更低, 而且結(jié)果判斷具有主觀性，容易產(chǎn)生偏差。另外，感染、結(jié)石等亦可影響細(xì)胞的形態(tài)而造成假陽性[2]。鑒于尿細(xì)胞學(xué)和膀胱鏡檢查存在的種種缺陷，尿液診斷膀胱癌一直是研究熱點(diǎn)并取得了一定的成果。?

2.獲FDA批準(zhǔn)的膀胱癌尿液檢測(cè)方法

獲FDA(美國食品和藥品管理局)批準(zhǔn)的膀胱癌尿液檢測(cè)方法迄今只有尿核基質(zhì)蛋白22、膀胱腫瘤抗原（BTA）、免疫細(xì)胞檢查法( ImmunoCyt) 、纖維素和纖維蛋白原降解產(chǎn)物及熒光原位雜交（FISH）5項(xiàng)。上述方法除FISH以外均已應(yīng)用多年，但和FISH一樣都存在敏感度和特異度不足的問題，只能作為細(xì)胞學(xué)和膀胱鏡檢查的補(bǔ)充，無法替代[3]。

2.1 核基質(zhì)蛋白22（NMP22）?

NMP22是組成細(xì)胞核內(nèi)部結(jié)構(gòu)的支架,而且同DNA復(fù)制、RNA合成、激素聯(lián)接、基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。作為一種核有絲分裂器蛋白，NMP22在分裂間期含量很少。膀胱癌時(shí)大量腫瘤細(xì)胞凋亡并將NMP22釋放入尿，使其水平可增高25 倍。以10 kU/ mL為臨界時(shí)，它對(duì)膀胱癌診斷的敏感度為69.7 %，特異度為78.5 %，對(duì)浸潤性膀胱癌診斷的敏感度為100 %[4]。但膀胱癌患者尿中NMP22 水平增高，與腫瘤的分級(jí)、分期不相關(guān)。盡管NMP22的敏感度較細(xì)胞學(xué)檢查高很多，但研究證實(shí)在有膀胱炎癥和其他腫瘤如腎細(xì)胞癌存在時(shí)，NMP22水平也升高，因此對(duì)于已經(jīng)確診為膀胱癌的病人來說，NMP22顯得更精確一些。

2.2 膀胱腫瘤抗原(BTA)?

BTA是膀胱腫瘤在浸潤和生長過程中釋放的蛋白水解酶降解基底膜的各種成分形成的膠原片段、糖蛋白、蛋白多糖等釋放進(jìn)入膀胱腔內(nèi)形成的復(fù)合物。單抗免疫分析法BTA - stat檢測(cè)敏感度67 %～87 % ,對(duì)于膀胱移行細(xì)胞癌（BTCC）術(shù)后隨訪腫瘤的特異度49 %～70 %[4] ,可用于BTCC 的篩查。由于敏感度特異度偏低，近年已逐漸被其他方法所取代。?

2.3 免疫細(xì)胞學(xué)檢測(cè)?

免疫細(xì)胞學(xué)檢測(cè)是細(xì)胞學(xué)和免疫熒光的結(jié)合，即用單克隆熒光抗體檢測(cè)膀胱癌脫落細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志物。總體敏感度和特異度一般，約為86％和79.4%[2]，而且需要專門的實(shí)驗(yàn)室和培訓(xùn)技術(shù)人員，應(yīng)用面不廣。?

2.4 纖維素/纖維蛋白原降解產(chǎn)物?

纖維素/纖維蛋白原降解產(chǎn)物是由纖溶酶作用于纖維素和纖維蛋白原后所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)片段。膀胱腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子能夠增加微小血管的通透性，從而引起血漿蛋白漏出。凝血因子快速將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維素，然后再被纖溶酶進(jìn)一步降解成纖維素降解產(chǎn)物（FDP）。目前常用的Colorimetric FDP 實(shí)驗(yàn)簡單快速診斷膀胱癌總的敏感度82.1 %，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)TCC 的敏感度分別為63.2 %、88.2 %和95 %。對(duì)于健康者,其他尿路疾患和膀胱鏡檢未見異常的TCC 復(fù)查者,其特異度別為96 %、86 %和80 %[5]。但在前列腺癌、膀胱炎癥，尤其是腎盂腎炎的病人，F(xiàn)DP實(shí)驗(yàn)很容易出現(xiàn)假陽性。

2.5 熒光原位雜交?

熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization ,FISH)是用熒光標(biāo)記的核酸探針和中期或間期細(xì)胞DNA雜交，檢測(cè)DNA 序列及其變化的方法。具有快速、無創(chuàng)性、敏感度高和特異度強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。?

膀胱癌細(xì)胞易發(fā)生非隨機(jī)的染色體改變，包括結(jié)構(gòu)畸變和染色體數(shù)目異常。常見結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w有3、9、1、5、11 、21 、17 ，染色體數(shù)目異常有3、9、7、10 、11 、Y、1、8、17 、15 [6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)9 號(hào)染色體部分或全部丟失在膀胱腫瘤中最常見，超過50 %膀胱癌患者有此染色體改變，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的早期事件和關(guān)鍵步驟；其次是17 號(hào)染色體畸變，可能與腫瘤浸潤行為有關(guān)，因?yàn)橛?7號(hào)染色體非整倍體的腫瘤具有更高復(fù)發(fā)率和浸潤性；7號(hào)染色體畸形也常見于膀胱癌，以三倍體多見，也可有四倍體(約占38 %)，它可以單獨(dú)出現(xiàn)在膀胱癌，但更多是伴隨其他染色體改變一起發(fā)生；3 號(hào)染色體異常在BTCC約占30 % ，而且常與其他染色體的異常并存，可以有染色體移位和數(shù)量變化，與復(fù)發(fā)有關(guān)。其他染色體異常有男性膀胱癌約半數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)Y染色體丟失，11 號(hào)染色體單體等。?

FISH的一個(gè)重要特征就是能比膀胱鏡更早發(fā)現(xiàn)膀胱癌，膀胱鏡陰性FISH陽性的術(shù)后隨訪病例在3～12個(gè)月中有41％～68％被確診為膀胱癌，而雙陰性的情況下只有19％在3～19個(gè)月后確診為膀胱癌。Vysis 公司研發(fā)的Urovysion 試劑盒通過熒光原位雜交分析尿脫落細(xì)胞染色體3、7、17號(hào)非整倍體和染色體9p21丟失以診斷膀胱癌，據(jù)稱能達(dá)到85％的敏感度和97％的特異度[7]。?

FISH存在的問題有Ta、Tis期腫瘤相對(duì)敏感度較低。尿液量不夠，低腫瘤負(fù)荷，腫瘤細(xì)胞未脫落也可能對(duì)敏感度有影響。而且高昂的價(jià)格和繁瑣的操作過程也影響了它的應(yīng)用和推廣。?

由于這些診斷方法依然無法滿足臨床需要，近年來，經(jīng)過廣大科研人員的努力，發(fā)現(xiàn)了很多具有診斷潛力的膀胱癌分子標(biāo)志物。?

3. 研究中的分子診斷方法

3.1 染色體檢測(cè)?

3.1.1 短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測(cè) 在腫瘤發(fā)生機(jī)制上，除了癌基因激活以外，抑癌基因失活也起了極大的作用。通常抑癌基因失活多通過雜合性缺失途徑（LOH），包括兩個(gè)獨(dú)立的過程，一個(gè)等位基因所在染色體片段缺失和另一個(gè)等位基因發(fā)生突變或甲基化，是膀胱癌時(shí)p16抑癌基因失活的最常見機(jī)制。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）是研究LOH的最常用方法。微衛(wèi)星是廣泛存在于原核及真核細(xì)胞基因組中的簡單串聯(lián)重復(fù)序列,其數(shù)目巨大且分布廣泛。人基因組中平均約50 kb 就有一個(gè)位點(diǎn)存在，是基因復(fù)制或細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體不對(duì)等交換產(chǎn)生的寡核苷酸重復(fù)序列。大量研究顯示, 在TCC 中存在總體上染色體的不穩(wěn)定性, 多條染色體多個(gè)區(qū)段發(fā)生LOH。研究證明只需做20個(gè)高信息含量位點(diǎn)就可以達(dá)到充足的信息量[8](敏感度95％以上）用以檢測(cè)各種類型膀胱癌，而且不受腫瘤病理分級(jí)和分期的影響。另有研究顯示微衛(wèi)星改變存在人種差異或病因?qū)W差異，因而選擇地域、種族特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)組合,有可能顯著提高膀胱腫瘤診斷的敏感度和特異度。有研究表明,在膀胱炎性改變時(shí)尿沉渣微衛(wèi)星分析有很高的假陰性,雖然微衛(wèi)星在研究LOH方面是值得信賴的，但是由于大量的LOH模式尚未清晰，還需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力去研究，再加上MSI分析需要異常細(xì)胞含量占到10％以上，以及尿沉渣細(xì)胞無法滿足的大量DNA，這些都限制了它的應(yīng)用。Utting等[9]認(rèn)為, 利用尿液離心后上清液中游離的DNA (無細(xì)胞沉淀物)作為檢測(cè)標(biāo)本分析微衛(wèi)星異常診斷膀胱癌優(yōu)于尿液細(xì)胞沉淀物, 其原因可能是上清液中腫瘤DNA與正常細(xì)胞DNA 的比值高于尿沉淀物, 更利于檢測(cè)LOH。?

3.1.2 單核苷酸多態(tài)性檢測(cè) DNA的單核苷酸多態(tài)性（SNP）亦是研究LOH的方法之一。他們大量存在于人類染色體中，大約相隔100－300bp就有一個(gè)，因此檢測(cè)SNP比微衛(wèi)星技術(shù)敏感度更高[10]?，F(xiàn)有的檢查手段,包括尿液細(xì)胞學(xué)檢查和一些分子標(biāo)志物檢查都受一些問題的困擾,例如難以區(qū)分腫瘤細(xì)胞和炎性細(xì)胞,對(duì)于高分化癌診斷的陽性率過低等,尿液脫落細(xì)胞SNP的檢測(cè)有可能克服這些缺點(diǎn),成為膀胱癌早期診斷的理想指標(biāo)[11]。但SNP檢測(cè)的不足也很明顯，使用基因芯片的方法成本比較高，另外尚無證據(jù)表明能幫助腫瘤的分級(jí)和分期。

3.1.3 甲基化檢測(cè) CpG島是人類基因啟動(dòng)子富含CpG雙核苷酸的區(qū)域,在正常狀態(tài)下是未甲基化的,其甲基化狀態(tài)與基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)活性有關(guān),并因此影響基因的功能。隨著甲基化檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)和不斷改進(jìn),發(fā)生啟動(dòng)子過甲基化的基因數(shù)目在迅速增加。CpG島的過甲基化幾乎在每種類型的腫瘤中都有發(fā)生,并且涵蓋了DNA修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、細(xì)胞代謝等各個(gè)方面[12]。?

由于膀胱癌發(fā)生的機(jī)制具有多樣性，因此在不同膀胱癌中檢出的發(fā)生甲基化位點(diǎn)也不盡相同。至今仍無單個(gè)基因能達(dá)到足夠診斷的敏感度和特異度的例子。但很多研究人員使用不同的位點(diǎn)組合檢測(cè)膀胱癌病理標(biāo)本已經(jīng)達(dá)到了90％以上的敏感度和特異度[12]，受尿沉渣細(xì)胞量的限制，敏感度普遍稍低，雖然亦有100％的報(bào)道，但尚缺乏大樣本研究證實(shí)。?

甲基化研究有助于腫瘤分級(jí)分期和預(yù)后判斷。Catto等[13]研究了12個(gè)基因啟動(dòng)子的甲基化情況，檢出率為86％。其中RARb，DAPK，CDH－1，RASSF1A甲基化情況和腫瘤分期相關(guān)，DAPK，RASSF1A啟動(dòng)子甲基化陽性的膀胱癌更容易惡化并且后者和高病死率密切相關(guān)。對(duì)于原位癌（pTa），DAPK或者h(yuǎn)MLH1甲基化預(yù)示著更高的復(fù)發(fā)概率。pT1患者中RARb甲基化的腫瘤不易進(jìn)展，病死率也低。CDH－1在pT2－4的患者中有一定的保護(hù)意義。Friedrich等[14]從抑癌基因、凋亡相關(guān)基因、黏附分子、血管生成等4大類21個(gè)基因中篩選出6個(gè)基因甲基化和膀胱癌復(fù)發(fā)相關(guān)。給甲基化研究又添加了一項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。?

甲基化檢測(cè)的手段多種多樣，現(xiàn)在常用的甲基化特異性PCR還具有如下優(yōu)點(diǎn)：①高通量，高敏感，最低能檢出含量只有0.1%～0.01％的異常DNA，能早期檢出微小的腫瘤甚至是癌前病變。②不像突變檢測(cè)，無需對(duì)基因進(jìn)行測(cè)序、排除變異情況等復(fù)雜的前期準(zhǔn)備。③相比LOH檢測(cè)能省去血液匹配檢測(cè)等麻煩的過程[15]。但其缺點(diǎn)也很明顯，需要亞硫酸鹽處理過夜，步驟較多，費(fèi)時(shí)較長，模板在處理之后變成小片段，影響擴(kuò)增，泌尿系統(tǒng)其他腫瘤脫落細(xì)胞可能會(huì)混雜其中影響結(jié)果判斷。