流式細(xì)胞儀多色染色與同型對(duì)照抗體選擇與搭配
一、如何搭配流式抗體熒光標(biāo)記 流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個(gè)因素決定的： 流式細(xì)胞儀能檢測(cè)多少個(gè)通道 需要同時(shí)檢測(cè)檢測(cè)多少個(gè)指標(biāo) 廠家的抗體有多少種熒光標(biāo)記 如果流式細(xì)胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時(shí)做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多 A 、 如何根據(jù)流式細(xì)胞儀搭配流式抗體 1） BD流式細(xì)胞儀（06版目錄第614頁(yè)） BD流式試劑選擇及應(yīng)用的相關(guān)問(wèn)答與簡(jiǎn)介 流式細(xì)胞儀能檢測(cè)多少個(gè)通道是由有多少根激光決定的以及每根激光的功能決定的，所以首先需要注意兩點(diǎn)： 流式細(xì)胞儀有哪些激光。比如標(biāo)配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三個(gè)熒光通道/三個(gè)顏色，而選配的Calibur (FACSCalibur的簡(jiǎn)稱(chēng))配有488nm和635nm兩根激光，可以檢測(cè)FL1-FL4四個(gè)通道/4個(gè)顏色。 不同型號(hào)的流式細(xì)胞儀的同樣的一個(gè)通道檢測(cè)熒光素的能力是不一樣的，比如Calibur的FL3（第3通道）能檢測(cè)PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能檢測(cè)PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP。 Calibur第3通道能檢測(cè)的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測(cè)。Calibur和LSR都能檢測(cè)4個(gè)顏色，但是第4個(gè)通道檢測(cè)熒光素是不一樣的 搭配熒光素原則 搭配流式熒光素有2個(gè)原則： 每個(gè)通道只能選擇1 種熒光素； 各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配 ， 但需注意 1、每個(gè)通道只能選擇1種熒光素。以Calibur為例說(shuō)明，Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇Alexa Fluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC Calibur的FL3通道盡管能檢測(cè)PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個(gè)熒光素，但是我們我們搭配的時(shí)候只能選擇其中1個(gè)。 2、各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配：如果客戶(hù)的流式細(xì)胞儀能做4個(gè)通道，在第1個(gè)原則之下，那么每個(gè)通道隨便選出1個(gè)熒光素就可以組合成4個(gè)顏色。以2跟激光的Calibur為例，Calibur各個(gè)熒光素之間可以搭配出16種組合。比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )＋P E（F L 2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 這個(gè)搭配組合可以更改成Alex Fluro(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+Alex Fluro(FL4)，或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PE-Cy5（FL3）+APC(FL4)等等?？傊?，在第1原則之下，我們可以隨意搭配和組合各個(gè)熒光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，上流式以后，容易導(dǎo)致補(bǔ)償過(guò)度。 B 、 BD 公司抗體有多少種熒光素 1） 供應(yīng)商能提供的每種抗體的熒光素是不一樣的我們需要根據(jù)同時(shí)結(jié)合供應(yīng)商能提供的每種抗體的熒光素進(jìn)行搭配。原則上同一個(gè)標(biāo)志的不同的克隆號(hào)帶同1個(gè)熒光素在應(yīng)用上沒(méi)有區(qū)別的，但是有些不同克隆號(hào)的抗體之間可能會(huì)有一些稍微的差異，需要仔細(xì)看說(shuō)明書(shū)。我們可以盡量選擇在說(shuō)明書(shū)上有流式圖形的抗體，或者選擇熒光素種類(lèi)最多的克隆號(hào)的抗體 2） 熒光素 為什么要推薦使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢？ 因?yàn)檫@些熒光非常明亮，對(duì)激光非常穩(wěn)定，適合流式細(xì)胞儀的光譜性質(zhì)，對(duì)PH值不敏感，具有水溶性。此外，他們聯(lián)合使用時(shí)發(fā)射光譜存在巨大差異，無(wú)需補(bǔ)償。 C、如果檢測(cè)的指標(biāo)數(shù)目超過(guò)了流式細(xì)胞儀的通道，怎么辦？ 如果需要做5個(gè)指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀只能做4個(gè)通道，首先將指標(biāo)歸成2類(lèi)，再將樣本分成2份，分別檢測(cè)。比如需要同時(shí)檢測(cè)CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。 二、同型對(duì)照（Isotypy Control ） 1 、為什么要用同型對(duì)照？ 同型對(duì)照是使用與一抗相同種屬來(lái)源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型對(duì)照是真正意思上的陰性對(duì)照，它不但可以用來(lái)設(shè)定流式細(xì)胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細(xì)胞因子競(jìng)爭(zhēng)封閉步驟。在流式細(xì)胞儀上樣前，染色方式如下： 樣本管：一抗＋樣本 同型對(duì)照管：同型對(duì)照＋樣本 2 、如何選擇同型對(duì)照？ 樣本管：純化的CDw25＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1＋樣本 同型對(duì)照管：純化的同型對(duì)照＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1＋樣本 如果沒(méi)有找到適合的同型對(duì)照，在保持來(lái)源相同、熒光標(biāo)記相同、免疫球蛋白類(lèi)別相同條件下，那么優(yōu)先選擇的順序應(yīng)該是亞鏈不同－－亞型不同－－相同類(lèi)別。比如，某種的抗體的來(lái)源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對(duì)照表里面找到不到完全相同的同型對(duì)照，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2а為同型對(duì)照。如果也沒(méi)有找到Mouse IgG2а，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2b作為同型對(duì)照。如果最后還是沒(méi)有找到Mouse IgG2b，那么選者相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2作為同型對(duì)照。 3 、哪些客戶(hù)需要使用同型對(duì)照？ A 對(duì)流式不是非常熟悉的客戶(hù)。 B 做胞內(nèi)流式客戶(hù)，比如胞內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子和信號(hào)蛋白等。 C 使用不常見(jiàn)的標(biāo)志或者特異性不高的標(biāo)志的客戶(hù)，因?yàn)榭蛻?hù)不熟悉不常見(jiàn)標(biāo)志的表達(dá)情況，根據(jù)同型對(duì)照可以判斷陽(yáng)性細(xì)胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié)合非常多，使用同型對(duì)照可排除假陽(yáng)性。 D 對(duì)流式非常熟悉又使用常用的表面標(biāo)志的客戶(hù)，一般可以不使用同型對(duì)照。 4 、為什么有時(shí)候同型對(duì)照的表達(dá)會(huì)比抗體的表達(dá)高？ 首先需要檢查同型對(duì)照的抗體是否加錯(cuò)類(lèi)型、劑量等。其次，因?yàn)橛行?biāo)志在細(xì)胞的表面或者胞內(nèi)表達(dá)不高，而跟其類(lèi)似的抗原非常多，那么加入同型對(duì)照時(shí)，同型對(duì)照非特異性的結(jié)合會(huì)超過(guò)抗體的特異性，所以會(huì)造成這種現(xiàn)象，在細(xì)胞表面時(shí)如圖所示。這個(gè)時(shí)候推薦使用其他陰性對(duì)照，如空白對(duì)照等。 三、補(bǔ)償微球 流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償 隔一段時(shí)間之后需要調(diào)整到適合的位置。如果熒光補(bǔ)償沒(méi)有調(diào)節(jié)好，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分群不明顯或者流式檢測(cè)得到的結(jié)果圖非常不漂亮，而且會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果的不真實(shí)。熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)對(duì)初學(xué)者來(lái)說(shuō)非常不容易掌握，同時(shí)，補(bǔ)償調(diào)節(jié)是流式細(xì)胞術(shù)中比較難掌握的操作。尤其是一些不常見(jiàn)的標(biāo)志檢測(cè)時(shí)，需要經(jīng)驗(yàn)非常豐富的流式操作者根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)判斷調(diào)節(jié)補(bǔ)償，才可以得到比較好的數(shù)據(jù)和圖片。 那么，現(xiàn)在不需要這么麻煩。因?yàn)檠a(bǔ)償微球讓一切變得更簡(jiǎn)單。 BDTM CompBeads 是專(zhuān)用于流式細(xì)胞儀多色分析的熒光補(bǔ)償調(diào)整微球。它的實(shí)用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析時(shí)補(bǔ)償難調(diào)、耗費(fèi)樣本（往往用待測(cè)樣本單標(biāo)來(lái)進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)）的缺點(diǎn)。 它本身不攜帶任何熒光，借助于與客戶(hù)自己的特異性熒光抗體孵育結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償。它不但能象待測(cè)的樣本細(xì)胞一樣在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下固定、破膜等，操作起來(lái)很簡(jiǎn)單，靈敏度高，一致性好，使補(bǔ)償更輕松更準(zhǔn)確，而且最難得的是它最適合于多色分析（如五色、六色、七色等）和復(fù)合熒光素（如 PE-Cy7 、 APC-Cy7 等），因?yàn)檫@時(shí)的補(bǔ)償往往難度較大。各型號(hào)的流式儀器均能使用。 Compbeads 使用后可以將流式的條件保存，方便下次做同樣的熒光染色搭配時(shí)參考用。 (責(zé)任編輯：大漢昆侖王) |
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技術(shù)原理
