周正洪組：冷凍電鏡研究蛋白組比傳統(tǒng)方法強在哪？
自DNA重組技術(shù)和蛋白親和純化方法問世以來，研究人員利用蛋白異源表達純化技術(shù)與X射線晶體衍射學(xué)方法解析了大量蛋白的高分辨結(jié)構(gòu)，極大地豐富了我們對細(xì)胞中各種重要生命過程分子機制的認(rèn)知【1】。然而這種方法需要大量高純度蛋白樣品，無法應(yīng)用于異源系統(tǒng)表達量較低或或不易結(jié)晶的蛋白樣品，比如大的蛋白復(fù)合物。另外，由于蛋白異源表達過程涉及蛋白序列的剪切、突變及添加標(biāo)簽，這種方法獲得的重組蛋白結(jié)構(gòu)可能無法準(zhǔn)確反映細(xì)胞中內(nèi)源蛋白的分子作用機理。
近年來冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展迅猛【2,3】。與傳統(tǒng)方法相比，冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)對蛋白樣品的數(shù)量和純度要求大大降低，且可獲得蛋白不同構(gòu)象結(jié)構(gòu)【4-8】。周正洪組進一步發(fā)現(xiàn)冷凍電鏡單顆粒技術(shù)可用于研究從細(xì)胞勻漿直接富集的內(nèi)源蛋白樣品，從同一樣品中獲得多個內(nèi)源蛋白的近原子分辨率電鏡結(jié)構(gòu)。這種高通量的自下而上的結(jié)構(gòu)蛋白組研究方法樣品制備流程簡單，可捕捉到蛋白在細(xì)胞內(nèi)行使功能時的結(jié)構(gòu)，但也產(chǎn)生了非常有趣且富有挑戰(zhàn)性的問題：這些近原子分辨率電鏡結(jié)構(gòu)是什么？該如何搭建原子模型？
2019年11月25日，加州大學(xué)洛杉磯分校（UCLA）周正洪組在Nature Methods在線發(fā)表題為Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu文章，提出一種自下而上的高通量結(jié)構(gòu)蛋白組研究方法。利用該方法，研究人員可直接從細(xì)胞勻漿富集多種內(nèi)源性蛋白，并利用冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)獲得多個近原子分辨率（未知）電鏡結(jié)構(gòu)。作者開發(fā)的cryoID程序可準(zhǔn)確、高效地從數(shù)萬條候選序列中鑒別出未知電鏡結(jié)構(gòu)的蛋白序列，并輔助原子模型搭建工作。作為例證作者將該方法應(yīng)用于引起瘧疾的惡性瘧原蟲，獲得了多個重要蛋白復(fù)合物的近原子分辨率結(jié)構(gòu)。該方法為具有挑戰(zhàn)性的蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究提供了新思路。
周正洪組提出從未知電鏡結(jié)構(gòu)中選取高分辨率區(qū)域進行序列搭建（以下稱檢索序列），然后利用序列搜索比對方法從候選序列庫（可由蛋白樣品質(zhì)譜分析獲得）中鑒別出目標(biāo)蛋白序列。由于部分氨基酸側(cè)鏈形狀非常相似，僅僅根據(jù)電鏡結(jié)構(gòu)側(cè)鏈密度圖進行準(zhǔn)確的氨基酸預(yù)測與檢索序列搭建非常困難（例如天冬氨酸D和天冬酰胺N很難被區(qū)分開）。為應(yīng)對這個挑戰(zhàn)，周正洪組根據(jù)二十種氨基酸側(cè)鏈形狀相似性將它們簡化為六個類，并使用簡化類進行檢索序列搭建與搜索。例如，天冬氨酸D和天冬酰胺N被歸為亮氨酸類（用L表示），在檢索序列搭建過程中將它們預(yù)測為亮氨酸類即可。簡化類的使用引入了容錯機制，大大提高了檢索序列的準(zhǔn)確率。周正洪組開發(fā)的cryoID程序可自動定位未知冷凍電鏡結(jié)構(gòu)中信號好的區(qū)域并搭建檢索序列原子模型供用戶查看，之后cryoID調(diào)用經(jīng)優(yōu)化的BLASTP程序?qū)喕臋z索序列和候選序列進行序列搜索比對，找到匹配的蛋白序列【9,10】。利用模擬數(shù)據(jù)和已發(fā)表電鏡結(jié)構(gòu)的測試結(jié)果表明，cryoID可從上萬條候選序列（蛋白組或由質(zhì)譜分析獲得的候選序列庫）中準(zhǔn)確、高效鑒別出目標(biāo)蛋白序列。
惡性瘧原蟲可引起瘧疾。使用傳統(tǒng)方法進行惡性瘧原蟲蛋白結(jié)構(gòu)解析遭遇了極大挑戰(zhàn)。周正洪組將他們的結(jié)構(gòu)蛋白組研究方法應(yīng)用于惡性瘧原蟲，從同一樣品中獲得了三種蛋白的四個近原子分辨率結(jié)構(gòu)，經(jīng)cryoID鑒別是M18 aspartyl aminopeptidase，glutamine synthetase和20S proteasome兩個不同構(gòu)象結(jié)構(gòu)。
論文的共同第一作者是UCLA的Chi-Min Ho博士和中國科大的李曉潤博士，通訊作者是UCLA的周正洪教授。有多位來自不同學(xué)科的研究人員參與此項目。
專家點評
劉攀、王祥喜（中科院生物物理所）
冷凍電鏡技術(shù)通過近一二十年的快速發(fā)展已經(jīng)成熟地用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析。但是通過冷凍電鏡密度圖直接識別和鑒定蛋白質(zhì)卻因為潛在候選蛋白的數(shù)量眾多和電鏡密度圖整體與局部的分辨率起伏變化而陷入瓶頸。文章提出了基于對細(xì)胞環(huán)境中富集蛋白質(zhì)復(fù)合物的近原子分辨率的冷凍電鏡模型的自下而上的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的組學(xué)方法，以及開發(fā)了僅在蛋白質(zhì)的冷凍電鏡密度圖信息的基礎(chǔ)上準(zhǔn)確唯一識別蛋白質(zhì)ID的CryoID程序。其中最為重要的最后一步主要通過近原子分辨率（3.0~4.0?）的冷凍電鏡密度模型結(jié)構(gòu)與由選擇、預(yù)測、簡化和搜索四步組成的cryoID程序?qū)崿F(xiàn)。對已存在的結(jié)構(gòu)驗證證實了方法的可行性與程序的準(zhǔn)確性。
此方法的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在：
1.僅需要map的信息就可以鑒定蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定方法對實驗條件要求很高，實驗周期較長，而通過冷凍電鏡map運行程序就可以實現(xiàn)氨基酸序列的確定和樣品的蛋白質(zhì)鑒定，為解放繁雜的實驗操作提供了可能性。
2.氨基酸容錯度的引入、評價體系的合理確定與科學(xué)的參數(shù)調(diào)試極大地提高了cryoID程序?qū)τ诘鞍踪|(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性和廣泛性。將20種氨基酸按照其側(cè)鏈的冷凍電鏡密度相似度分成6類，并在兼顧查詢序列與候選蛋白序列的匹配效率與匹配準(zhǔn)確度條件下，通過參數(shù)調(diào)試確定最佳的查詢序列數(shù)量和長度，從而大大縮短了匹配所需的時間。
3.為難以結(jié)構(gòu)表征的蛋白質(zhì)的預(yù)測和蛋白質(zhì)新構(gòu)象態(tài)的識別提供了潛在的工具。對于像P.falciparum這樣與醫(yī)學(xué)高度相關(guān)的病原體難以使用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)重組方法進行結(jié)構(gòu)表征，通過對其高分辨的冷凍電鏡密度圖來從候選池中確定蛋白質(zhì)的種類無疑是一種有效的方案。同時，此方法還為多種天然構(gòu)象狀態(tài)（例如，結(jié)合伴侶的變化）和生物過程的各個階段（例如，寄生蟲的生命周期）捕獲的復(fù)合物的準(zhǔn)確鑒定打開了的大門。
但是，由于CryoID程序的蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性很大程度上依賴于冷凍電鏡map的分辨率，導(dǎo)致該方法不適用于map質(zhì)量較差的蛋白質(zhì)（例如柔性蛋白質(zhì)的內(nèi)在無序區(qū)域）的預(yù)測。然而一個好消息是，通過CryoID程序可以大大縮小候選池中蛋白質(zhì)的數(shù)量。
專家點評
孫林峰（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)）
隨著冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)的發(fā)展和成熟，解析生物大分子高分辨三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)變得相對容易。相比于晶體學(xué)手段，冷凍電鏡技術(shù)對樣品量和均一度的要求大幅降低，我們已經(jīng)時常可以看到利用同一套電鏡數(shù)據(jù)，觀察到同一蛋白處于不同構(gòu)象狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，甚至同時解析出不同蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)的這一優(yōu)勢為研究內(nèi)源性生物大分子樣品的三維結(jié)構(gòu)開辟了一條捷徑，特別是在細(xì)胞中豐度較高的蛋白或復(fù)合物分子。但是，目前利用單顆粒技術(shù)解析的生物大分子結(jié)構(gòu)的整體分辨率大多在3埃到4埃范圍內(nèi)。對于內(nèi)源性純化的樣品，由于其組分復(fù)雜，時常存在一些之前未被鑒定的蛋白成員。在相對較低的分辨率下，很難單純依靠密度圖來確定未知組分的來源，并搭建完整的序列結(jié)構(gòu)。
在這篇文章中，周正洪教授課題組針對這一問題提出了一套自下而上的高通量結(jié)構(gòu)蛋白組學(xué)的方法，將冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)相關(guān)聯(lián)，在解析內(nèi)源性蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用其開發(fā)的cryoID程序，可準(zhǔn)確、高效地從數(shù)萬條候選序列中鑒別出未知電鏡結(jié)構(gòu)的蛋白序列，并輔助原子模型的搭建。將這一方法應(yīng)用在惡性瘧原蟲的內(nèi)源蛋白結(jié)構(gòu)解析中，課題組成功獲得了多個重要蛋白復(fù)合物的近原子分辨率結(jié)構(gòu)，包括兩個之前未知結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物。該方法巧妙借鑒了經(jīng)驗豐富的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家搭建原子模型的最初過程，先利用清晰的密度部分，根據(jù)氨基酸的側(cè)鏈特征，推測最有可能的蛋白序列，進而確定整個蛋白的序列走向。在推測蛋白序列的過程中，課題組設(shè)計了6種簡化的氨基酸模型（G/L/K/P/Y/W），對應(yīng)不同側(cè)鏈形狀和大小的氨基酸，從而提供了一定的容錯空間。之后，利用推測的具有一定長度的序列，在質(zhì)譜結(jié)果提供的序列數(shù)據(jù)庫中進行比對搜索，找到最可能對應(yīng)的蛋白分子。
利用這套近乎全自動的前導(dǎo)原子模型搭建和未知蛋白組分鑒定程序，可以非常好的輔助對內(nèi)源蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，完善了冷凍電鏡模型搭建的方法軟件。利用計算機代替人腦的“推測”過程，并且與實驗數(shù)據(jù)結(jié)合，在省去大量人力勞動的同時，極大提高了組分鑒定的準(zhǔn)確率。值得一提的是，這一方法不僅在內(nèi)源富集的蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究中具有很好的應(yīng)用前景，同時也適用于一些組分復(fù)雜且具有高度動態(tài)變化的大分子復(fù)合物研究中，例如在之前對剪接體（splicesosome）的研究，就從結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了之前未鑒定的復(fù)合體組分。
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