冷凍電鏡可用來(lái)檢測(cè)化合物
冷凍電鏡（Cryo-electron microscopy，Cryo-EM）能夠?qū)焖倮鋬鲈诮咏烊粻顟B(tài)的蛋白復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。現(xiàn)在，冷凍電鏡不僅可用于測(cè)定生物大分子的結(jié)構(gòu)，還可用于分子量相對(duì)較小的蛋白復(fù)合物，包括膜蛋白。這種強(qiáng)大的技術(shù)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法如X射線晶體學(xué)（XRD）和核磁共振（NMR）的不足，尤其適用于基于結(jié)構(gòu)的藥物研發(fā)方面?！?/p>
*TRPV5(瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道亞家族V成員5)與益康唑抑制劑結(jié)合。摘自TET Hughes et al, Structural basis of TRPV5 channel inhibition by econazole revealedby cryo-EM.
離子通道
X射線晶體學(xué)需要制備衍射晶體才能獲得原子分辨率的結(jié)構(gòu)。如果您致力于具有挑戰(zhàn)性的靶點(diǎn)，這將是非常大的一個(gè)障礙。我們現(xiàn)在正在研究的每個(gè)靶點(diǎn)幾乎都非常具有挑戰(zhàn)性。
--康涅狄格州格羅頓市輝瑞公司副研究員
Seungil Han 博士
作為細(xì)胞之間運(yùn)輸和交換的主要手段，離子通道是一個(gè)非常重要的研究對(duì)象。雖然離子通道對(duì)于許多疾病都有非常顯著的影響，然而由于其很難結(jié)晶出來(lái)，所以被認(rèn)為是非常具有挑戰(zhàn)性的治療靶點(diǎn)。一旦從其天然的膜環(huán)境中提取出來(lái)，離子通道的結(jié)構(gòu)就會(huì)坍塌。
冷凍電鏡不僅可以揭示天然脂質(zhì)環(huán)境中離子通道的結(jié)構(gòu)，還可以揭示其打開(kāi)和關(guān)閉的狀態(tài)，這對(duì)于理解離子通道的開(kāi)關(guān)機(jī)制至關(guān)重要。
冷凍電鏡無(wú)庸置疑是測(cè)定離子通道各種構(gòu)象狀態(tài)結(jié)構(gòu)的首選技術(shù)。
--Carus Lau et al. J Physiol
596.7 (2018) pp 1107–1119
胰島素結(jié)合
醫(yī)學(xué)的進(jìn)步使糖尿病成為一種可控的疾病，延長(zhǎng)了糖尿病患者的生存期， 并提高了其生存質(zhì)量。然而，直到最近，胰島素與其受體的結(jié)合方式尚不明確。只有明確了結(jié)合機(jī)制，才能開(kāi)發(fā)出更有效的治療方法。
胰島素受體 (Insulin receptor，IR) 是一種二聚蛋白，在控制葡萄糖穩(wěn)態(tài)、調(diào)控脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物的代謝，以及調(diào)控腦神經(jīng)遞質(zhì)水平方面起著至關(guān)重要的作用。目前已知IR功能障礙與許多疾病相關(guān)，包括糖尿病、 癌癥和阿爾茨海默氏癥。
--默克公司資深首席科學(xué)家
Giovanna Scapin 博士
默克公司首席科學(xué)家Giovanna Scapin博士多年來(lái)一直致力于胰島素和糖尿病的研究。她還是冷凍電鏡的先驅(qū)用戶之一。多虧了單顆粒分析技術(shù)，她的團(tuán)隊(duì)才能夠精準(zhǔn)確定胰島素與胰島素受體之間的相互作用，從而為藥物開(kāi)發(fā)開(kāi)辟了令人興奮的新途徑。
*冷凍電鏡獲得的電子云密度圖(線框)疊加在胰島素-受體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)上。
*單顆粒分析技術(shù)獲得的片段抗原與 sGP 結(jié)合的電子云密度圖。
病毒和抗體
埃博拉病毒會(huì)引起人類(lèi)和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重出血熱。目前，尚未有批準(zhǔn)的針對(duì)埃博拉病毒的治療方法問(wèn)世。埃博拉病毒的毒性可能部分源自于分泌型糖蛋白（sGP），它是從其GP基因轉(zhuǎn)錄的主要產(chǎn)物。sGP 從感染的細(xì)胞中分泌出來(lái)，在被埃博拉病毒感染的宿主血清中可以很容易地檢測(cè)出來(lái)。了解蛋白與其抗體之間的結(jié)合機(jī)制可用于未來(lái)的疫苗設(shè)計(jì)和治療。
來(lái)自Scripps研究所的Andrew Ward博士研究小組使用冷凍電鏡繪制出抗體在抗原表位結(jié)合圖，分辨率為4.3?，為評(píng)估患者對(duì)疫苗抗體的反應(yīng)提供了根據(jù)。
GPCR功能
G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCRs）是調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界刺激的多種反應(yīng)的膜蛋白。它涉及多種疾病，是重要的藥物靶標(biāo)；超過(guò)50%的現(xiàn)代蛋白質(zhì)藥物都與GPCRs相關(guān)。作為膜蛋白，GPCRs非常大，結(jié)構(gòu)柔性好，且難以結(jié)晶，這意味著很難使用傳統(tǒng)的分析技術(shù)（例如：NMR和XRD）來(lái)表征其結(jié)構(gòu)。
來(lái)自Thermo Fisher Scientific 的科學(xué)家與Mazdak Radjainia 博士共同進(jìn)行的合作項(xiàng)目成功地使用冷凍電鏡分析了GPCR的結(jié)構(gòu)。另外，冷凍電鏡可以對(duì)GPCRs家族蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分組和單獨(dú)表征，因此也被研究人員用于捕獲這些復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)特性。
*GPCR復(fù)合物在冷凍電鏡上獲得的電子云密度圖。圖形由Chimera(PDB ID: 5UZ7 )繪制。
阿爾茨海默氏癥與神經(jīng)退行性疾病
人口老齡化問(wèn)題為全社會(huì)帶來(lái)了前所未有的廣泛流行性疾病。阿爾茨海默氏癥（Alzheimer’s Disease，AD）是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾癥，并且隨著個(gè)體壽命的持續(xù)增長(zhǎng)，每年報(bào)告的病例數(shù)也在增加。在世界范圍內(nèi)，至少有4400萬(wàn)人患有癡呆癥，全球每年用于癡呆癥患者的費(fèi)用高達(dá)6040億美元。到2030年，預(yù)計(jì)癡呆癥患者將達(dá)到7600萬(wàn)。
研究人員正在嘗試使用多種方法在分子水平上診斷、治療和鎖定阿爾茨海默氏癥的病因。英國(guó)劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Anthony Fitzpatrick最近將冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，解析了tau蛋白的結(jié)構(gòu)，該蛋白被認(rèn)為是病理上導(dǎo)致阿爾茨海默氏癥的主要致病因素。
tau蛋白纖維與阿爾茨海默氏癥的病理有關(guān)。它們?cè)诎柎暮Ｄ习Y患者的大腦中大量聚集纏繞在一起。這些蛋白可以直接從患者身上提取出來(lái)，然后冷凍并用冷凍電鏡進(jìn)行分析，從而得到非常接近于體內(nèi)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的結(jié)果。
*冷凍電鏡上獲得的tau蛋白纖維的電子云密度圖（透明部分）。相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（彩色部分）與之相吻合。
其他分析技術(shù)通常關(guān)注大的tau蛋白的片段，這提供了大量的細(xì)節(jié)，但缺乏相關(guān)環(huán)境對(duì)結(jié)構(gòu)的影響等信息。冷凍電鏡能夠在接近其天然環(huán)境條件下對(duì)蛋白進(jìn)行成像，在結(jié)構(gòu)測(cè)定中能夠提供有價(jià)值的相關(guān)環(huán)境影響信息，獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。
質(zhì)譜技術(shù)能夠幫助判定冷凍電鏡樣品生化制備結(jié)果的好壞?？茖W(xué)家將二者結(jié)合起來(lái)，測(cè)定了tau蛋白的近原子分辨率結(jié)構(gòu)，從而揭示出潛在的藥物靶點(diǎn)。這項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性的項(xiàng)目刊登在《自然》雜志2017年7月的封面上。
我們使用質(zhì)譜來(lái)驗(yàn)證結(jié)構(gòu)，組成，處理和分解片段。通過(guò)質(zhì)譜來(lái)了解磷酸化的位點(diǎn)，并觀察其他進(jìn)來(lái)的蛋白質(zhì)，哪些在纖維中，哪些在組織中……總之，是將蛋白質(zhì)組學(xué)和冷凍電鏡相結(jié)合。
--英國(guó)劍橋大學(xué)MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室
Anthony W. P. Fitzpatrick
得到原子分辨率的細(xì)節(jié)而無(wú)須結(jié)晶
Bartesaghi等人（Structure, v.26（6）, p.848-856, Jun 5, 2018）使用冷凍電鏡清晰地觀察到β-半乳糖苷酶四聚體的側(cè)鏈，甚至可以看到帶有內(nèi)部空腔的芳香環(huán)。
分辨率和大小方面的進(jìn)展
自2012年以來(lái)，冷凍電鏡可以觀察到分析物最小尺寸和分辨率都在不斷 提高?，F(xiàn)在，超過(guò)2?的分辨率可以看到小于0.5 MDa 分子量的結(jié)構(gòu)。盡管這些極限的情況在很大程度上取決于樣品的對(duì)稱性和復(fù)雜性，但這種趨勢(shì)顯示出冷凍電鏡應(yīng)用具有非常廣闊的前景。
*(A) 冷凍電鏡測(cè)定了β-半乳糖苷酶四聚體的電子云密度圖。
*(B) 單個(gè)β-半乳糖苷酶亞基。
*(C) 冷凍電鏡測(cè)定出單條側(cè)鏈的電子云密度圖，能清晰地看到所有20個(gè)主要氨基酸。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬確定的側(cè)鏈構(gòu)象被嵌入到結(jié)構(gòu)模型之中。
[冷凍電鏡]技術(shù)[最新]的進(jìn)展已經(jīng)能夠測(cè)定與抑制劑苯乙基-b-D-硫代半乳糖苷相結(jié)合的β-半乳糖苷酶的……電子云密度圖，其中有序區(qū)域在X射線電子云密度圖上可見(jiàn)的分辨率約為1.5?。
