單向、雙向免疫瓊脂擴散和免疫電泳-1
可溶性抗原與相應(yīng)抗體以合適的比例發(fā)生特異反應(yīng)時，在一定溫度和電解質(zhì)存在的條件下，形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)的抗原可以是多糖、蛋白質(zhì)、脂類等。
根據(jù)抗原與抗體的不同條件及其它因素，沉淀反應(yīng)可以分為以下三種主要形式。即：環(huán)狀沉淀反應(yīng)(ring precipitation
reaction)，凝膠中沉淀反應(yīng)(precipitation reaction in
gel)，如單向擴散、雙向擴散、對流電泳、免疫電泳以及微生物學(xué)實驗中的絮狀沉淀反應(yīng)(flocculation precipitation
reaction)，如梅毒血清檢驗中的康氏（Kahn）及克萊氏（Kline）試驗以及檢測白喉桿菌毒力的體外試驗-Elek
氏試驗，檢測毒素或類毒素的絮狀沉淀單位測定等。本實驗主要介紹凝膠中的沉淀反應(yīng)。
（一） 單向免疫擴散(Single immunodiffusion)—人群血清IgG 正常值測定
一、基本原理
在含有特異抗體的瓊脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，當(dāng)抗原向周圍擴散后與瓊脂中抗體相結(jié)合，即形成白色沉淀環(huán)，其直徑或面積與抗原濃度呈正相關(guān)。同時用標(biāo)準(zhǔn)抗原或國際參考蛋白制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可用以定量檢測未知標(biāo)本的抗原濃度(mg/ml
或U/ml)。應(yīng)用這一實驗方法可檢測正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM 的水平。
二、實驗材料
2%離子瓊脂或生理鹽水瓊脂（內(nèi)含2%NaN3）。
標(biāo)準(zhǔn)馬抗人IgG 血清（抗體）（北京生物制品研究所生產(chǎn)）
工作標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白（北京生物制品研究所生產(chǎn)）
pH7.2 PBS.
打孔器（孔徑3mm）及打孔模板
微量加樣器
濕盒（容器內(nèi)加濕紗布或泡沫塑料）
已制備好的含有1%馬抗人IgG 抗體的瓊脂板
1/50 稀釋的單人份待檢血清標(biāo)本
三、實驗方法
（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：
1．按照玻片的大小，準(zhǔn)備制做瓊脂板所需要的1%離子瓊脂。首先分裝其 1/2 量的2%鹽水瓊脂，例如，用普通載玻片制做時需1%離子瓊脂4ml，在分裝 2%鹽水瓊脂時即為2ml。溶化后置56°C~60°C 水浴中平衡溫度備用。
2．稀釋抗體，用pH7.2 的PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗人IgG 抗體，終濃度為抗體效價的一倍。例如，血清效價為1/140，原濃血清即應(yīng)按1/70 稀釋。并分裝試管，其分裝量應(yīng)與2%鹽水瓊脂量相等。
3．制備瓊脂板：將已稀釋的抗人IgG 抗體于56°C 水浴中預(yù)熱約半分鐘，再傾注于已溶化并維持56°C~60°C
的2%鹽水瓊脂管中，用拇指將管口堵緊。翻轉(zhuǎn)試管1-2
次，將抗體與瓊脂混合均勻（注意：抗體與瓊脂混合時切勿產(chǎn)生氣泡），即刻傾注于玻片上，待凝固后即可。
4．打孔：將瓊脂板置于模板上，在同一直線上用打孔器打孔5 個，孔距10mm。
5．稀釋不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白（工作標(biāo)準(zhǔn)）：應(yīng)根據(jù)制品說明進行稀釋，例如：工作標(biāo)準(zhǔn)中免疫球蛋白含量，IgG 為100 單位/ml，80.4 微克/單位，其稀釋范圍為1/10、1/20、1/40、1/80 及1/160。
6．加樣：將已稀釋的不同濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)蛋白依次用微量加樣器每孔加入 10ul。（注意：每一稀釋度均應(yīng)更換塑料吸頭）。
7．將加樣的瓊脂板放濕盒中，置37°C 溫箱，24 小時后觀察結(jié)果。
8．用量角規(guī)測量并記錄沉淀環(huán)直徑，然后以沉淀環(huán)直徑為縱座標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白量（單位/ml）為橫座標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
（二）人血清中IgG 正常值的測定：
1．將已制備好的抗體瓊脂板置打孔模板上，每一瓊脂板可打孔4 個（孔徑3mm，孔距10mm）。
2．將單位正常人血清用pH7.2 PBS 分別作1/50 稀釋。
3．用微量加樣器分別取1/50 稀釋的單人份血清標(biāo)本10μl 加入孔中，每份標(biāo)本應(yīng)各加兩孔。
2．作好標(biāo)記放濕盒中，置37°C 溫箱，24 小時后觀察結(jié)果。
四、實驗結(jié)果
測量各份標(biāo)本的沉淀環(huán)直徑并記錄結(jié)果，然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線測出每份標(biāo)本所含IgG 的量（U/ml，），并換算為mg/ml。統(tǒng)計全實驗室實驗結(jié)果并計算出均值。
單向免疫擴散示意圖
五、注意事項
1．在制做標(biāo)準(zhǔn)曲線時，為盡量減少誤差，至少應(yīng)做兩份以上標(biāo)準(zhǔn)板。
2. 加樣時，吸取每份標(biāo)本均應(yīng)更換塑料吸頭。
（二） 雙向免疫擴散 (Double immunodiffusion)—抗原分析
一、基本原理
雙向免疫擴散是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂介質(zhì)中相互擴散,彼此相遇后形成一定類型的特異性沉淀線。沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原抗體的特異性及相互間比例，而且與其分子大小及擴散速度相關(guān)。當(dāng)抗原、抗體存在多個系統(tǒng)時，可呈現(xiàn)多條沉淀線乃至交叉反應(yīng)。依據(jù)沉淀線的形態(tài)、清晰度及位置可了解抗原或抗體的若干性質(zhì)，如濃度、特異性等。
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焦點事件
