RiboPrinter? 在肉毒梭菌鑒定和分子分型中的應用（一）
RiboPrinter??在肉毒梭菌鑒定和分子分型中的應用
? 梭狀芽孢桿菌是一個多樣化的革蘭氏陽性菌屬，專性厭氧，在環(huán)境中普遍存在。這個屬大約包含了100多個種，基因組內(nèi)總體的G+C含量范圍在22-55%，反映出該屬內(nèi)的細菌在系統(tǒng)進化關系上的巨大差異。 該屬內(nèi)最主要的食源性致病菌為肉毒梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，它們均可通過毒素介導，通過直接產(chǎn)生毒素（如食源性肉毒中毒），或在腸道內(nèi)生成毒素（如嬰兒肉毒中毒和產(chǎn)氣莢膜梭菌腹瀉），從而引發(fā)食源性細菌性疾病。
? 肉毒梭菌簡介 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）屬于厭氧性梭狀芽孢桿菌，為革蘭氏陽性的多形態(tài)大桿菌，芽孢位于菌體近端，使菌體呈匙形或網(wǎng)球拍狀。根據(jù)抗原性的不同，肉毒梭菌可分為8個型，分別是A、B、Cα、Cβ、D、E、F和G型。 肉毒梭菌產(chǎn)生的外毒素稱為肉毒神經(jīng)毒素（BoNTs，botulinum neurotoxins），肉毒毒素在目前已知毒素中毒性最強，一個人的致死劑量大約為1?μg，比氰化鉀毒力大10000倍，和炭疽一樣，可作為生物武器。BoNTs可引發(fā)食物中毒，即肉毒中毒，能夠引起人類中毒的主要型別為A、B和E型。肉毒中毒的臨床表現(xiàn)不同于其他食物中毒，胃腸道癥狀很少見，主要為神經(jīng)末梢麻痹，發(fā)病率不高，但死亡率居細菌性食物中毒之首。 肉毒梭菌是一種腐物寄生菌，在自然界分布廣泛，食物中肉毒梭菌主要來源于環(huán)境，如塵埃、糞便等，尤其是帶菌土壤。肉毒梭菌的抵抗力一般，在45℃以上都受到抑制，80℃經(jīng)20min可被殺滅。但其芽孢的抵抗力極強，可耐煮沸長達1-6h之久，于180℃干熱5-15min或于120℃高壓蒸汽下10-20min才能滅活，在酒精中可存活2個月，10%的HCl需60min才能破壞芽孢。蛋白分解型的肉毒梭菌（A、B和F型）芽孢比非蛋白分解型的B、E和F型的芽孢對熱具有更強的抵抗力。芽孢在厭氧環(huán)境的食品中可發(fā)芽繁殖產(chǎn)生肉毒毒素，人類因食入已產(chǎn)生毒素的食品而發(fā)生肉毒中毒。另外，因肉毒梭菌隨蜂蜜等食物進入嬰兒腸道內(nèi)產(chǎn)毒引發(fā)的嬰兒肉毒中毒也有存在。 ? 肉毒梭菌的形態(tài)特征和分類學
肉毒梭菌為多形態(tài)的厭氧性的桿狀菌，長約4-6?m，寬約0.6-1.2 ??m，兩側平行，兩端鈍圓，直桿狀或稍彎曲，可形成芽孢，卵圓形，位于次級端或偶有位于中央，常見很多游離芽孢，多單在，偶見成雙或短鏈，A型和B型菌的芽孢大于菌體，位于菌體近端，使菌體呈匙形或網(wǎng)球拍狀，其他的型芽孢一般不超過菌體寬度。有時呈現(xiàn)長絲狀或鏈狀，有時能見到舟形、帶把柄的檸檬形、蛇樣線狀和染色較深的球莖狀，這些屬于退化型，當菌體開始形成芽孢時，常常伴隨著自溶現(xiàn)象。肉毒梭菌具有4-8根周生性鞭毛，運動遲緩，沒有莢膜。
? 根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》，肉毒梭菌歸屬為原核生物界、厚壁菌門、厚壁菌綱、芽孢桿菌科的梭菌屬（Clostridium）。
? 肉毒梭菌這個種是基于單一的表型特征，即產(chǎn)生BoNTs的這個特性來分類定義的。Collins等（1998）又將其分為4個組（Group ?I-IV），這些群呈現(xiàn)出非常多樣化的基因型和表型特征（見表一），菌株之間的差異程度要遠遠超過枯草芽孢桿菌（Bacillus ?subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株之間的差異程度。
? 這種情況有時更為復雜，導致分類學上的困難，因為有些菌株從發(fā)育關系上來說與肉毒梭菌非常相近，但是并不產(chǎn)生神經(jīng)毒素，因而沒有歸入肉毒梭菌這個種，如生孢梭菌（Clostridium ?sporogenes），諾維氏梭菌（Clostridium ?novyi），和其他一些未命名的梭菌；而有些菌株能生產(chǎn)神經(jīng)毒素，卻因系統(tǒng)發(fā)育較遠，并未歸入肉毒梭菌，如巴氏梭菌（Clostridium ?baratii）以及酪酸梭菌（Clostridium ?butyricum）。更復雜的情況是，Collins等（1998）還發(fā)現(xiàn)BoNTs的毒力基因能在菌株間不穩(wěn)定地平行轉移，從而產(chǎn)生不產(chǎn)毒的變種，或是攜帶部分或未知的BoNTs基因。正因為肉毒梭菌的種內(nèi)多樣性，導致了對于該細菌的分類學研究仍存在爭議，給各種肉毒梭菌的檢測、分離和鑒定方法，甚至是16S測序法鑒定都帶來了一定的難度。
? 表一：肉毒梭菌的基本特征
特征 | 組I | 組II | 組III | 組IV |
毒素類型 | A,?B,?F | B,?E,?F | C,?D | G |
人類疾病病原 | 是 | 是 | 是 | 否 |
最低生長溫度（℃） | 10 | 3.3 | 15 | 不確定 |
最適生長溫度（℃） | 35-40 | 18-25 | 40 | 37 |
最低生長pH值 | 4.6 | 5.0 | 5.0 | 不確定 |
最低生長水活度Aw | 0.94 | 0.97 | 不確定 | 不確定 |
氯化鈉抑制 | 10% | 5% | 2% | 不確定 |
芽孢D100℃值（分鐘） | 25 | <?0.1 | 0.1-0.9 | 0.8-1.12 |
芽孢D121℃值（分鐘） | 0.1-0.2 | <?0.001 | 不確定 | 不確定 |
蛋白分解活性 | 是 | 否 | 否 | 微弱 |
脂肪分解活性 | 是 | 是 | 是 | 否 |
糖分解活性 | 否 | 是 | 微弱 | 否 |
相近的非產(chǎn)毒梭菌屬菌種 | C.?sporogenes C.?putrificum | C.?beijerinkii | C.?novyi C.?haemolyticum | C.?subterminale C.?histolyticum C.?linosium |
毒力基因位置 | 染色體 | 染色體 | 噬菌體 | 質(zhì)粒 |
基因組G+C含量（mol%） | 26-29 | 27-29 | 26-28 | 28-30 |
肉毒梭菌的傳統(tǒng)鑒定和分離方法
正如前述，肉毒梭菌這個種是基于單一的表型特征，即產(chǎn)生BoNTs的這個特性來分類定義的，所以傳統(tǒng)的表型和基因型鑒定方法，如生化反應、細胞脂肪酸組分分析以及16S測序等并不能給出明確的鑒定結果，見Collins（1998），Brett（1998），Ghanem（1991）。比如，16S測序方法已被證實無法區(qū)分肉毒梭菌及其兩個近親：諾維氏梭菌（Clostridium ?novyi）和生孢梭菌（Clostridium sporogenes）。
? 肉毒梭菌培養(yǎng)分離的第一步是增菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的確定。培養(yǎng)基可優(yōu)先選用預還原性（Pre-reduced）厭氧無菌的熟肉基質(zhì)培養(yǎng)基（可含或不含葡萄糖成分）（cooked ?meat medium），碎肉葡萄糖淀粉培養(yǎng)基（chopped-meat glucose-starch ?medium），或胰蛋白胨葡萄糖酵母提取肉湯（tryptone-peptone glucose yeast extract ?broth）。胰蛋白酶可被添加到配方中以滅活細菌素和激發(fā)神經(jīng)毒素。溶菌酶的加入有助于復活熱損傷的孢子，尤其適合于非蛋白分解型肉毒梭菌的菌株。
? 由于不同組別的肉毒梭菌的最適生長條件并不統(tǒng)一（見表一），所以最優(yōu)的培養(yǎng)溫度的選擇仍然是個問題。Solomon（2001）等推薦采用28℃用于II組肉毒梭菌的培養(yǎng)，而用35℃用于其他組別的培養(yǎng)，不過目前已經(jīng)有質(zhì)疑認為其不適用魚類和貝殼類食品中肉毒梭菌的檢測。Anon（1998）等推薦采用30℃用于所有組別的菌株的培養(yǎng)，但在這個條件下I組的菌株得不到最優(yōu)的生長。
? 培養(yǎng)5天后，接種的肉湯需做小鼠生物實驗（Mouse Bioassay）以檢測BoNTs的產(chǎn)生情況。另需培養(yǎng)10天以檢測受損芽孢或延遲產(chǎn)芽菌株的生長情況仍然是十分必要的。所有的培養(yǎng)物還需最終通過鏡檢檢測，觀察菌株的形態(tài)特征，以獲得鑒定結論。
? 疑似陽性的肉湯樣本，連同疑似原因食品和臨床樣本（尤其是糞便）還需選用上述培養(yǎng)基進行嚴格厭氧環(huán)境下的二次培養(yǎng)以進行確認。培養(yǎng)基需包含以下成分： 卵黃：以檢測酯酶陽性的肉毒梭菌菌株，見Silas（1985） 選擇性抗菌劑：環(huán)絲氨酸，磺胺甲基異惡唑，甲氧芐啶等，見Silas（1985），Dezfulian（1981），Mills（1985） 由于肉毒梭菌不同組別菌株存在較大差異（尤其是I組和II組），專家們一致建議采用含抑菌劑和不含有抑菌劑的選擇性平板同時進行對照實驗，以便分析和獲得更為準確的結果。
? 典型的肉毒梭菌的菌落形態(tài)見圖一： Typical colonial growth of C. botulinum, together with an atypical ?lipase negative culture: Classically, C. botulinum colonies are usually ?gray-white on blood containing agars with circular irregular edges, and a ?clear zone of β-hemolysis.
Clostridium botulinum growing on blood agar （Below Left） Clostridium botulinum growing on egg yolk agar showing the lipase reaction after 72 hours of incubation （Below Right）
? 主要的肉毒梭菌的生化特征見表二和表三： 表二：各型肉毒梭菌的生化特性
型別 | A | B | C | D | E | F |
葡萄糖發(fā)酵 | + | + | + | + | + | + |
麥芽糖發(fā)酵 | + | (±) | (±) | (±) | (±) | (±) |
乳糖發(fā)酵 | - | - | (-) | (-) | - | - |
蔗糖發(fā)酵 | (-) | (±) | - | - | - | (+) |
靛基質(zhì)產(chǎn)生 | (±) | - | (-) | (-) | - | - |
明膠液化 | - | (+) | (±) | (±) | (±) | (+) |
牛奶消化 | (+) | (±) | - | - | - | (+) |
注：肉毒梭菌的生化形狀并不規(guī)律，即使同型也常見到株間差異；+表示陽性，-表示陰性，(±)表示視菌株而定，(+)表示多為陽性反應，(-)表示多為陰性反應。
? 表三：各組肉毒梭菌的生化特性 ?
組別 | I組 | II組 | III組 | IV組 | |||||||
芽孢位置 | S | T | S | T | S | T | S | T | |||
動力 | + | - | + | + | - | + | |||||
有氧環(huán)境 | - | - | - | - | |||||||
葡萄糖 | + | + | + | - | |||||||
乳糖 | - | - | - | - | |||||||
麥芽糖 | - | + | d | - | |||||||
甘露醇 | - | - | - | - | |||||||
卵磷脂酶 | - | - | - | + | - | ||||||
酯酶 | + | + | + | - | |||||||
