細(xì)胞凋亡檢測實驗——Annexin-V-FITC 單染法
| 實驗方法原理 | 細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細(xì)胞的生命現(xiàn)象之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的清除等方面起著十分重要的作用。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死，它有一系列的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細(xì)胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細(xì)胞，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1. ?凋亡細(xì)胞的制備 2. ?200 μl細(xì)胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10?分鐘，棄上清。 3. ?重復(fù)步驟2兩次。 4. ?將細(xì)胞重懸于200 μl 標(biāo)記緩沖液。 5. ?加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 分鐘或4 ℃反應(yīng)30 分鐘。 6. ?加入300 μl標(biāo)記緩沖液，立即上機（流式細(xì)胞儀）檢測。 展開? |
| 注意事項 | 1. ?整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4 ℃下操作。 ? 2. ?反應(yīng)完畢后要盡快檢測，因為細(xì)胞凋亡是一個動態(tài)的過程，反應(yīng)一小時后熒光強度就開始衰變。 3. ?Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時要注意避光。 |
| 其他 | 一、實驗結(jié)果 用熒光顯微鏡觀察，凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜上可見黃綠色光環(huán)。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是調(diào)亡所特有的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。以FITC標(biāo)記的Annexin V, 可以同時結(jié)合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式細(xì)胞儀分析可檢測凋亡細(xì)胞的百分率。 |
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