免疫組化&病理診斷（二）
2.5對“未分化”惡性腫瘤的分類
未分化惡性腫瘤包括癌或肉瘤，在HE切片上由于腫瘤的“未分化”而缺少腫瘤細胞的起源特征不能分類，初步區(qū)分組織學類型用非特異性抗體，在其基礎上再選用特異性抗體做進一步鑒定。如分化差的癌可顯示Vimentin或S-100蛋白，有時淋巴瘤可以表達上皮膜抗原，一些黑色素瘤表現(xiàn)出角蛋白，這同時也強調(diào)了在腫瘤診斷中應使用一組抗體而不是單個抗體。
2.6進一步分類不同器官與組織交界處腫瘤
由于重疊的特征，在一些組織器官交界處的腫瘤，僅憑組織學基礎對腫瘤進行分類很困難。如胃腸道梭形細胞肉瘤是肌肉起源的平滑肌肉瘤，是間質(zhì)起源的胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)，還是神經(jīng)起源的神經(jīng)鞘瘤;同樣發(fā)生于組織交界處的腫瘤有睪丸胚胎癌與精原細胞癌，兩者較難區(qū)別，且治療與預后顯著不同，但用免疫組化檢測角蛋白就較易于區(qū)別:角蛋白陰性則為精原細胞癌，而角蛋白陽性則為胚胎癌。
2.7及時準確的發(fā)現(xiàn)微小轉移灶
采用常規(guī)病理方法難以檢出的實體瘤轉移稱為微小轉移灶。在常規(guī)組織切片中，辨別單個或幾個轉移性腫瘤細胞很難，淋巴結內(nèi)竇性組織細胞增生與某些癌的早期轉移有時也不易區(qū)別，而采用免疫組化方法，有助于及時準確的發(fā)現(xiàn)微小(癌)轉移灶。對乳腺癌而言主要是腋窩淋巴結的檢測，淋巴結微轉移患者預后差，這對進一步治療和預后判斷十分有意義。
2.8與治療和預后有關的免疫組化標記物
與治療及預后有關的標記物主要分以下為三類:(1)腫瘤基因標記物:如癌基因C-erbB2、c-myc、P53蛋白等，卵巢上皮性癌中P53的過表達與腫瘤的擴散、分化、術后殘存癌灶呈正相關;乳腺癌中表達C-erbB2的浸潤性癌患者預后差;肺癌中突變型P53基因蛋白表達增高，PTEN基因表達減弱，提示腫瘤預后不良。(2)細胞增殖性標記物:腫瘤細胞增生是否活躍直接影響者臨床的治療與預后，如表皮生長因子受體(EGFR)、Ki-67、PCNA、cycling等可對腫瘤細胞的增生做出評價，表達指數(shù)越高，表明其增殖指數(shù)越活躍，惡性度增高，預后不良，其中以惡性淋巴瘤、乳腺癌較為明顯;在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Ki-67、EGFR陽性者，淋巴結轉移率高，并與激素受體的表達呈負相關。(3)類固醇激素受體:如雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)等，應用最為廣泛的是子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌，如對乳腺癌中ER、PR的檢測，有助于決定臨床治療中是否需要加入內(nèi)分泌激素阻斷治療，并能判斷預后，ER及PR陽性表達、原癌基因(C-erbB-2)陰性表達病例對三苯氧胺等激素治療反應良好，而ER、PR、C-erbB-2三種抗體均陰性(TNBC)患者采用三苯氧胺可能意義不大。
2.9對感染性疾病診斷
應用抗病毒、細菌、真菌和寄生蟲抗原的特異性抗體進行免疫組化染色，可以檢測和診斷許多感染性疾病病原微生物，如乙型肝炎病毒(HBV)、巨細胞病毒(CMV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、皰疹病毒(HSV)、丙型肝炎病毒(HVC)、細小病毒B19、人禽流行性感冒病毒(AIV)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS)等等，由于免疫組化在感染性疾病診斷中具有及時性、低風險性、高敏感性、特異性、有效性等特點，可以用于(1)用于人類新病原微生物的識別;(2)提供快速的形態(tài)學診斷，使嚴重感染性疾病得以早期治療;(3)在無法取得新鮮組織或尚無培養(yǎng)方法的情況下，提供診斷并對發(fā)病機制進行研究和認識。
2.10藥物靶點免疫組化
免疫組化及分子病理學方法在疾病診斷中僅僅起輔助治療的作用，而藥物病理學是用病理學的方法確定藥物治療的靶點、評價藥物治療的療效、預測藥物治療的反應，因此藥物靶點免疫組化屬“獨立診斷”。因此對于對照的設置、質(zhì)量的控制均需要更高的要求，如對試劑的要求，不同于一般的診斷試劑，應按對藥物管理的要求操作。HER2蛋白著色3+者可作為臨床醫(yī)生建議患者接受曲妥珠單抗等藥物治療的依據(jù)。
3、免疫組化的局限性
靈敏度高、精確性和特異性是一種理想的腫瘤標記物必須具有的，但至今所發(fā)現(xiàn)的腫瘤標記物還沒有能完全滿足這些標準。某些正常細胞也分泌一些腫瘤標記物，因此腫瘤細胞學并不是單獨產(chǎn)生一種標記物，即選用一組抗體比單一抗體更有利。在腫瘤診斷中評估免疫組化的局限性主要在抗體特異性和解釋方面。在免疫組化操作中都必須有適當?shù)年栃耘c陰性對照，作為技術完整性質(zhì)量控制，如對照組被忽略或不理想時，免疫組化染色的結果要謹慎對待，免疫組化的正確結果不僅要依靠技術步驟上規(guī)范化操作，而且有賴于正確的解釋，在報告免疫組化染色結果時不應孤立地解釋，應考慮到診斷與鑒別診斷、所應用的抗體特性、所研究組織性質(zhì)，同時還要注意假陽性與假陰性結果的干擾。
3.1假陽性
陽性信號定位不正確即為假陽性，包括著色不勻、背景著色、邊緣效應，另外組織的某些特定成分也能導致假陽性結果。假陽性可能的原因有:(1)一抗?jié)舛燃耙豢故欠袷?，抗體有一個合適的濃度范圍且必須在有效期內(nèi)使用，過期的抗體或者不著色，或者背景著色，形成假陽性;(2)試劑未充分覆蓋組織，組織邊緣的試劑易干濃度較組織中間高致深染;(3)抗體孵育時間過長，由于室溫的影響夏季孵育時間稍短，冬季孵育時間稍長;(4)操作過程中組織變干，造成組織邊緣收縮或損壞形成偽影，產(chǎn)生假陽性;(5)3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色時間太長，DAB宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配制時間最好在30min以內(nèi);(6)由于胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此間質(zhì)和胞漿中出現(xiàn)很多非特異性的染色，如內(nèi)源性酶血紅蛋白、肌紅蛋白等造成的著色，可以通過血清封閉解決;乳腺癌組織中的脂肪細胞、淋巴細胞也會產(chǎn)生非特異性的染色;(7)非特異性抗體吸附常見于壞死組織中，使壞死組織呈較高的背景染色，在免疫組化中應避免選擇壞死組織較多的蠟塊。
3.2假陰性
免疫組化結果中的假陰性是指所有抗體標記的切片均呈陰性，無陽性信號，假陰性結果不是真實的反應。導致假陰性結果的原因有:(1)抗原修復方法選擇不當，根據(jù)不同的抗原特點采用不同的修復方法，大多數(shù)抗體要求熱修復，熱修復又包括高壓修復、微波修復及煮沸熱修復;而對某些細胞內(nèi)抗原和細胞間質(zhì)抗原需要用酶消化，如表皮生長因子(EGFR)要求胃蛋白酶(Pepsin)消化，而Vimentin則不用修復;(2)一抗本身的問題:一抗效價降低或失效。在免疫組化中染色結果的假陰性會導致錯診或漏診，進而影響臨床診斷及延誤治療。解決這一問題的可通過設立陽性對照，比較兩者染色結果。若陽性對照有表達，表明試劑和染色體系及實驗步驟均無問題;若陽性對照無表達，則檢測過程中某一試劑或某個步驟存在問題，應逐一查找原因。
4、免疫組化的質(zhì)量控制
免疫組化染色切片的好壞直接影響著病理醫(yī)生對其染色結果的判斷，進而影響病理診斷，所以制作一張良好的免疫組化切片至關重要，它需要病理醫(yī)生與病理技師兩者間的相互協(xié)調(diào)，密切配合和共同努力，病理醫(yī)生選擇抗體，設置對照，判讀結果，指導技術;而技術人員進行實驗操作，保證染色質(zhì)量。在免疫組化切片的制作過程存在多個環(huán)節(jié)，每一環(huán)節(jié)的失誤都可能影響最終的檢測結果，如抗原保存，蛋白酶消化，增強技術及對抗體的管理、使用和試劑的濃度等等，因此制作一張高質(zhì)量的免疫組織化學切片是多方面相互配合的結果。
為了保證免疫組化染色結果的可靠性，每個實驗室都必須進行有效的質(zhì)量控制，規(guī)范免疫組化操作流程與步驟，應注意以下幾點:(1)規(guī)范行為技術標準:例如使用中性福爾馬林(添加PBS的4%福爾馬林)固定，并且固定及時、烤片不宜時間過長及浸蠟溫度不宜過高等等，溫度過高會破壞抗原決定簇，產(chǎn)生假陰性;(2)試劑最佳濃度:試劑最佳濃度的確定受到固定方法、時間、組織處理過程的影響;最合適的稀釋度是以得到最大強度的特異性染色和最弱的背景染色為標準;(3)為了保證免疫染色的質(zhì)量，主要的步驟便是對照的設立，包括陽性對照、陰性對照和空白對照，須同時設立，以達到最佳的質(zhì)控效果。對已知存在抗原的陽性對照組，如含抗原的正常組織，最好是使用含少量抗原的瘤組織作為對照，使與所檢測切片中的抗原水平趨于一致，而且后者可能含有表達抗原的非瘤組織，可以作為內(nèi)部對照;陰性對照應用缺乏抗原的組織切片;空白對照可以采用非免疫血清，緩沖液取代初級抗原的位置?？傊?，只有陽性對照染色陽性，陰性對照組織陰性，這樣的免疫組化染色結果才有說服力;(4)抗原修復的一致性:抗原熱修復工具選用微波爐或高壓鍋，修復溫度及修復時間要盡量一致，修復溫度至少要達到100℃，且修復總時間不低于15min;修復液的PH值在7．0～8．0之間，如Tris(pH7～8)、EDTA(pH8．0)修復液;(5)熟悉抗體的陽性定位:每種抗體均有陽性定位，染色之前應確定該抗體陽性位置，是胞漿、胞膜或胞核，如ER、PR、P53、Ki-67定位于細胞核，若胞質(zhì)或胞膜陽性也為假陽性;CD4、CD5、CD8、CD20、CD30、C-erbB-2等定位于細胞膜，若胞質(zhì)彌漫陽性或細胞核陽性則為假陽性;還有的抗體可表現(xiàn)為二種陽性反應類型，如S-100可為核陽性也可伴有胞質(zhì)陽性;癌胚抗原(CEA)定位于胞漿或包膜。
在病理診斷中，隨著各種抗體新的用途不斷被發(fā)現(xiàn)及越來越多的新型抗體的出現(xiàn)，免疫組化在病理診斷和治療中已有了很重要的位置，對于腫瘤診斷、鑒別診斷、分類及諸多方面產(chǎn)生了重大的影響。但是免疫組化技術還存在著缺陷和不足，作為病理醫(yī)生和病理技術人員不僅要充分認識到缺陷和不足，而且要努力避免由于缺陷和不足給診斷帶來的誤區(qū)，這就要求病理醫(yī)生和病理技術人員在工作中不斷學習與研究，在實際操作中總結經(jīng)驗教訓，分析失敗原因，努力實現(xiàn)操作規(guī)范化、標準化，才能充分發(fā)揮免疫組化在病理診斷及鑒別診斷、臨床治療中的指導作用。
