飛行時間質(zhì)譜核酸檢測技術(shù)在臨床檢測中的應(yīng)用

2021.6.29

飛行時間(Time-of-Flight)質(zhì)量分析器是一種利用靜電場加速離子后，以離子飛行速度差異來分析離子質(zhì)荷比的儀器，與脈沖激光源基質(zhì)輔助激光解吸電離（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI）配合，組成了飛行時間質(zhì)譜。MALDI軟電離技術(shù)的發(fā)展，使得質(zhì)譜成為檢測生物大分子的重要手段。隨著技術(shù)的不斷改善，質(zhì)譜已經(jīng)成為生命科學(xué)中的重要工具，發(fā)展以質(zhì)譜為核心的臨床檢測、分子診療新技術(shù)是實現(xiàn)精準醫(yī)學(xué)的重要途徑。質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展歷程如圖1，平臺——優(yōu)化過的MALDI-TOF，技術(shù)路線如圖2。

圖1、質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展歷程

圖2、飛行時間質(zhì)譜核酸檢測實驗流程

深圳市第二人民醫(yī)院中心實驗室擁有功能齊備的分子診斷技術(shù)平臺，包括：標(biāo)準臨床基因擴增（PCR）實驗平臺、高通量測序標(biāo)準實驗平臺、臨床質(zhì)譜實驗平臺、細胞遺傳實驗產(chǎn)前診斷平臺、流式細胞術(shù)免疫診斷平臺、染色體微陣列分析（CMA）實驗技術(shù)平臺、數(shù)字PCR（Bio-Rad）實驗平臺、Luminex微流控芯片分析平臺、多組學(xué)生化實驗技術(shù)平臺。其中臨床質(zhì)譜平臺擁有3臺不同類型的質(zhì)譜儀，按購置順序分別為：MassArray核酸質(zhì)譜議用于SNP檢測及基因檢測項目研發(fā)；CLIN-TOF-II飛行時間質(zhì)譜儀用于SNP檢測、蛋白多肽檢測及微生物組學(xué)；UPLC-MS-MS串聯(lián)質(zhì)譜儀用于小分子、治療藥物監(jiān)測（TDM）及新生兒遺傳代謝疾病篩查等代謝組學(xué)檢測。相關(guān)設(shè)備見圖3。

圖3、中心實驗室臨床質(zhì)譜平臺

目前，我院中心實驗室開展最成熟的核酸質(zhì)譜檢測項目是新生兒遺傳性耳聾基因篩查，該項目從2016年開展至今，取得了很好的經(jīng)濟和社會效益，截至2018年底，累計完成8048例標(biāo)本的檢測量，總突變率為3.59%。遺傳性耳聾基因檢測是出生缺陷三級防控、優(yōu)生優(yōu)育領(lǐng)域重要的疾病防控項目：我國耳聾出生缺陷發(fā)生率約為1-3‰，正常人群耳聾基因攜帶率約為4.6%，新生兒傳統(tǒng)物理聽力篩查存在漏檢風(fēng)險， 80%聽力缺陷的患兒是由聽力正常的父母所生。

遺傳性耳聾基因核酸質(zhì)譜檢測與傳統(tǒng)基因檢測方法比較有明顯優(yōu)勢，具有全面、方便、準確、省時的特點：該項目可檢測4個常見耳聾基因（GJB2、SLC26A4、12rRNA、GJB3）的20個高發(fā)突變位點，標(biāo)本采集方便，口腔唾液、全血、足底血、臍帶血均可作為受檢標(biāo)本，從嬰兒至成年人均可監(jiān)測，準確率99%以上， 3天內(nèi)可出具檢測結(jié)果，報告解讀詳細，通俗易懂。核酸質(zhì)譜檢測的耳聾基因相關(guān)20個位點信息及檢測結(jié)果判讀見圖4、5。

圖4、遺傳性耳聾基因檢測的相關(guān)基因及位點信息

·圖5、耳聾基因核酸質(zhì)譜檢測結(jié)果判讀示意

遺傳性耳聾基因核酸質(zhì)譜檢測項目實驗設(shè)計周密，操作技術(shù)人員經(jīng)過1~2周項目操作培訓(xùn)可以勝任檢測操作，實驗所用儀器、試劑及實驗結(jié)果都具有良好的穩(wěn)定性。項目開展以來，實驗室連續(xù)兩年參加衛(wèi)生部同類項目室間質(zhì)評，均滿分通過。近3年的檢測結(jié)果匯總及室間質(zhì)評結(jié)果見圖6、7、8。

圖6、2016年6月~2018年12月耳聾基因項目突變率統(tǒng)計

圖7、2018年度耳聾基因項目突變率統(tǒng)計

圖8、耳聾基因核酸質(zhì)譜檢測項目連續(xù)2年滿分通過衛(wèi)生部室間質(zhì)評

深圳二院中心實驗室在開展遺傳性耳聾基因核酸質(zhì)譜檢測項目的同時，注重核酸質(zhì)譜檢測平臺項目的拓展，平臺應(yīng)用以來，相繼開展了鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險基因核酸質(zhì)譜檢測、腦膠質(zhì)瘤基因突變的核酸質(zhì)譜檢測項目探索，完成對數(shù)十例病例檢測和驗證，準確率100%；與此同時，在國家大力發(fā)展精準醫(yī)療的大背景下，實驗室在藥物基因組領(lǐng)域開展了卡馬西平、別嘌呤醇、氯吡格雷、華法林、他汀類等藥物基因多態(tài)性的核酸質(zhì)譜檢測方法探索，已經(jīng)完成引物設(shè)計及與現(xiàn)有PCR方法的比對，檢測結(jié)果準確率也是100%，但上述項目在臨床的應(yīng)用和推廣有待政策的支持。

實驗室還利用飛行時間質(zhì)譜進行了蛋白組學(xué)及微生物組學(xué)的相關(guān)研究探索：開展了幽門螺旋桿菌質(zhì)譜檢測研究、糖化血紅蛋白酶解效率質(zhì)譜檢測等研究。已經(jīng)完成的“急性白血病蛋白質(zhì)譜分型模型”研究課題（圖9），在質(zhì)譜檢測技術(shù)與基于聚類分析原理的人工智能數(shù)學(xué)模型結(jié)合應(yīng)用領(lǐng)域進行了有益探索。

圖9、急性白血病蛋白質(zhì)譜分型模型研究

實驗室于2018年底完成了串聯(lián)質(zhì)譜平臺建設(shè)，即將開展的新生兒48種遺傳代謝疾病篩查項目、血液神經(jīng)酰胺檢測項目、血清膽汁酸譜檢測項目及血液維生素含量檢測項目都將為臨床學(xué)科提供重要的疾病診斷技術(shù)。

未來，隨著質(zhì)譜儀性能的提升（高分辨質(zhì)譜儀的臨床應(yīng)用）、臨床大數(shù)據(jù)的匯集、人工智能技術(shù)的開發(fā)，質(zhì)譜檢測技術(shù)必將成為生命科學(xué)研究及疾病預(yù)測、診斷不可或缺的重要手段。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，這一強大的分析技術(shù)會越來越廣泛地應(yīng)用到疾病的預(yù)測與診斷中，為醫(yī)生提供診療技術(shù)支持，造福廣大患者。

質(zhì)譜飛行時間核酸檢測

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