玉米轉(zhuǎn)基因——試紙條檢測方法
1、目的
這個(gè)指南建立了檢測玉米（沒有經(jīng)過加工的玉米產(chǎn)品）中是否存在 StarlinkTM 玉米并出具官方被提供結(jié)果的程序。在美國谷物標(biāo)準(zhǔn)法（USGSA）的授權(quán)下，這個(gè)服務(wù)作為官方標(biāo)準(zhǔn)。
2、背景
由 Aventis 作物科學(xué)公司開發(fā)的 StarlinkTM 玉米，是運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)的方法，導(dǎo)入從細(xì)菌蘇云金稈菌（Bt）來的遺傳物質(zhì)經(jīng)過遺傳改良而得到。結(jié)果， StarlinkTM 玉米產(chǎn)生了一個(gè)蛋白質(zhì) Cry9C，具有殺蟲活性，能夠有效控制歐洲鉆心螟蟲，美國環(huán)境保護(hù)局在1998年批準(zhǔn) StarlinkTM 玉米僅僅做動(dòng)物飼料用。
由美國 SDI 公司提供的試劑盒 Trait V Bt9 Lateral Flow Test Kit，能在0.25％（400粒中有一粒 StarlinkTM 玉米）水平檢測 StarlinkTM 中的 Cry9C 蛋白。
測試方案不能準(zhǔn)確檢測樣品中 StarlinkTM 玉米的百分含量。檢測的僅僅是根據(jù)樣品的數(shù)目和大小，在一個(gè)指定的含量內(nèi)，判斷一個(gè)樣品是否含有 Cry9C 蛋白。
其他 Cry9C 蛋白檢驗(yàn)試劑盒，在被開發(fā)、評(píng)估和得到官方批準(zhǔn)可使用之后其使用程序?qū)?huì)被公布。
3、檢驗(yàn)可信度
基于取樣理論，每一扦樣批貨物的大小對樣品大小有重要的影響，這是谷物檢驗(yàn)的一般原則，總的樣品大小由可能接受的指定含量決定。分析方法的局限性決定了必須檢驗(yàn)多少個(gè)小樣。
官方扦樣程序已經(jīng)被發(fā)展為實(shí)用程序，用來獲得隨機(jī)樣品。增加樣品量能增加在低水平下檢測的可信度；然而，大樣品的可靠結(jié)果僅能通過檢驗(yàn)多個(gè)小樣而獲得。
下表說明了用試劑盒 Trait V Bt9 Lateral Flow Test Kit 檢驗(yàn)含有400粒的樣品獲得的。通過測試多個(gè)含有400粒的小樣，該表提供了在5個(gè)置信水平上的信息，該表提供了在所有的試驗(yàn)樣品出現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)，所期望的 StarlinkTM 最高百分含量水平。
試驗(yàn)樣品出現(xiàn)陰性結(jié)果與 StarlinkTM 最高百分含量水平關(guān)系
編號(hào)
使用400粒的小樣大小在5個(gè)不同可信水平的 StarlinkTM 百分含量
試驗(yàn)樣品出現(xiàn)陰性結(jié)果與??StarlinkTM??最高百分含量水平關(guān)系
| 編號(hào) | 使用400粒的小樣大小在5個(gè)不同可信水平的?StarlinkTM?百分含量 | ||||
| 50 | 75 | 90 | 95 | 99 | |
| 1 | 0.17 | 0.35 | 0.58 | 0.75 | 1.2 |
| 2 | 0.087 | 0.18 | 0.29 | 0.38 | 0.58 |
| 3 | 0.058 | 0.12 | 0.20 | 0.25 | 0.39 |
| 4 | 0.045 | 0.085 | 0.15 | 0.19 | 0.29 |
| 5 | 0.035 | 0.070 | 0.12 | 0.15 | 0.25 |
| 6 | 0.029 | 0.058 | 0.10 | 0.13 | 0.20 |
| 7 | 0.025 | 0.050 | 0.085 | 0.11 | 0.18 |
| 8 | 0.022 | 0.044 | 0.075 | 0.10 | 0.15 |
分析一個(gè)小樣，如果結(jié)果是 Cry9C 蛋白陰性，則一個(gè)扦樣批中不含有超過1.2％的 StarlinkTM 玉米的可能性為99％，同樣如果分析兩個(gè)小樣，兩個(gè)結(jié)果都是 Cry9C 蛋白陰性，則一個(gè)扦樣批中不含有超過0.58％的 StarlinkTM 玉米的可能性為99％。
4、樣品準(zhǔn)備
?。?）警告 檢驗(yàn)人員一定要額外小心，以免粗心混雜，確保樣品的整體性。在官方樣品中混入一粒外來樣品就能影響試驗(yàn)結(jié)果。保證樣品收集裝置（例如取樣鏟子、收集斗）和實(shí)驗(yàn)設(shè)備（樣品袋子、容器和分樣器）沒有殘留谷物。
?。?）樣品大小 根據(jù)《谷物檢驗(yàn)手冊子》第一冊《谷物取樣》的程序取樣。使用認(rèn)可的分樣器獲取需要分析小樣，保證原始樣品大小能足夠提供所有要求的小樣的分析，用作測試樣品，一般的刻度天平，可用作稱量樣品的縮分樣。
分析的小樣是115g（±5g）或大約400粒。這個(gè)大小要求適于所有的服務(wù)，包括呈送樣品。如有必要，通過稱100粒重然后乘以4來調(diào)節(jié)分析縮分樣大小至大約400粒。
?。?）測試的基礎(chǔ)（分析縮分樣大?。┏巧暾堈吡碛兄付?，應(yīng)把分析建立在樣品作為一個(gè)整體之上（在去除破碎粒和雜質(zhì)之前）。
5、測試程序
?。?）加工樣品
①取小樣測試縮分樣（大約400粒），用一般的刻度天平來稱重。
?、诎研臃诺揭粋€(gè)干凈干燥的用作搗碎的容器中（容器必須具有最小16液體盎司的容量）。
?、蹖⒁粋€(gè)干凈、干燥的刀片安裝到混合裝置上（食品加工器或混合器），在容器上放一個(gè)塑料保護(hù)罩，以防在樣品加工時(shí)，容器破裂。
④以高速磨碎小樣直到所有整粒被打碎（大約30s）。（注：也可用其他方法來磨碎小樣，只要磨碎的顆粒的大小與混合器加工相一致，加工要以免交叉污染。）
⑤把小樣從混合裝置上卸下來，然后加入143～145mL 水。
在容器上放一個(gè)蓋子反復(fù)搖動(dòng)，濕潤所有的玉米粉粒（大約10～20s），然后讓成泥漿狀的樣品放置15～30s，小樣應(yīng)該濃稠但又含有自由流動(dòng)的液體。
?、奘褂脵z測試劑盒的提供的移液管將 0.5mL 液體從容器轉(zhuǎn)移到 1.5mL 的樣品管中。（注：一些玉米成分在這一步驟中被轉(zhuǎn)移到樣品管中。）
?、呒?滴 Trait V 樣品緩沖液到樣管中（小心：沒有加5滴緩沖液到管中，可能引起假陽性結(jié)果。）
?、凵w上蓋子，搖動(dòng)大約10s。
?、岚?張 Trait V Bt99 測試條插入樣品管中，讓條帶置于試管中直到控制線（頂線）清楚可見，如果樣品是 Gry9C 蛋白陽性，測試線應(yīng)在 10min 內(nèi)形成。（注意：樣品管中的液體不要浸沒測試條帶頂部的箭頭。）
（2）Lateral Flow 測試條的結(jié)果分析在插入條帶之后，要時(shí)常檢查結(jié)果窗口，至少有一條控制線應(yīng)該在儲(chǔ)蓄墊下大約 1cm 處形成。在這個(gè)位置出現(xiàn)一條紅線說明該測試條的功能正常。在控制線下出現(xiàn)的一條紅線是測試線，這條紅線表明測試結(jié)果是陽性。
6、設(shè)備清洗和廢物處理
?。?）清洗 混合容器和刀片必須用肥皂水清洗，再清水漂洗，在重新用前必須晾干。
?。?）處理 將固體材料（如測試條，樣品管，磨碎的玉米）扔到一個(gè)固體廢物容器中進(jìn)行常規(guī)處理。液體材料（過量的樣品溶液）倒到下水道里。
7、儀器設(shè)備
?。?）檢測試劑盒材料 Trait V Bt9 Lateral Flow 測試條帶， Traits 樣品緩沖液，樣品管（1.5mL），移液管。
?。?）實(shí)驗(yàn)室設(shè)備 具有切割刀片墊片和混合/加工器的混合容器（至少453.6g），塑料保護(hù)罩，樣品管架，有刻度的量筒。
8、貯藏條件
在室溫下貯藏 Trait V Bt99 檢測試劑盒（15.5～29.4℃）。把檢測條保存在放有指示干燥劑的金箔小袋中，如果干燥劑不是藍(lán)色，不要使用檢測條或緩沖液。
