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Real-Time PCR (qPCR)常見問題及解決方案

2021.6.20

Real Time PCR(qPCR),即實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng),是一種利用熒光染劑檢測每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法技術(shù),是常規(guī)PCR的衍生反應(yīng)。主要是通過熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化,通過ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析。因其具有靈敏、特異、精確以及使用簡便等優(yōu)點,現(xiàn)已發(fā)展成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。

常用術(shù)語

首先先定義幾個術(shù)語先以確保澄清事實。

b07c3dc383cb4c12a8f93791e1f79ee9.jpeg基本概念

1.1 實時定量PCR的簡寫

建議實時定量PCR (quantitative real-time PCR) 應(yīng)當(dāng)簡寫為qPCR,反轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription–qPCR) 應(yīng)當(dāng)簡寫為RT-qPCR。用RT-PCR簡寫表示qPCR可以引起混亂,并且與傳統(tǒng)RT-PCR的平常應(yīng)用不符。

1.2 內(nèi)參基因

內(nèi)參基因應(yīng)當(dāng)指的是參照基因(reference genes),而不是管家基因(housekeeping genes)。

1.3 TaqMan探針

TaqMan探針應(yīng)指的是水解探針(hydrolysis probes)。

1.4 FRET probe

FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針)指的是一種機制,基于2個熒光基團的電子激發(fā)狀態(tài)之間的相互作用的基礎(chǔ)上的發(fā)光/淬火。LightCycler型探針指的是雙雜交探針(dual hybridization probes) 。

1.5 定量 quantification

牛津英語詞典只列出了定量(quantification),非定量(non-quantification),因quantification是恰當(dāng)?shù)摹?/p>

1.6 Cq

現(xiàn)在文獻中使用的閾值循環(huán)(threshold cycle, Ct),交點(crossing point, Cp)和分支點(take-off point, TOP) 與PCR反應(yīng)周期中的術(shù)語不一致。這些術(shù)語指的實際上在實時儀器是相同的值,只是不同儀器廠家為了競爭給自己產(chǎn)品的特定定義,不具有準(zhǔn)確性和清晰性。根據(jù)實時定量PCR的標(biāo)記語言的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)(www.rdml.org),建議同一使用定量循環(huán)(quantification cycle, Cq)這個術(shù)語。

1.7 基線(baseline)

一般默認為3~15個循環(huán)的信號值就是基線(baseline),是由測量的偶然誤差引起的。

463461c10f764d39833ea8d2c7bdd80e.png基線

1.8 閾值(threshold)

指在擴增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)的適當(dāng)位置上設(shè)定的熒光檢出界限,一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。

58c4289fe06a462e8b60d2e5711a70ed.png閾值

常見問題及解決方案

1.重復(fù)性很差

造成qPCR實驗重復(fù)性差的原因有以下幾點:

① 移液槍不準(zhǔn),加樣不準(zhǔn)確

這種情況下,我們可以更換性能更好的移液槍,擴大反應(yīng)體積,將模板做高倍稀釋,以大體積加入反應(yīng)體系中

② 定量PCR儀在不同位置溫度不一樣

這個需要定期校準(zhǔn)定量PCR儀

③ qPCR預(yù)混液未混合均勻

使用前應(yīng)充分混勻qPCR預(yù)混液

注:重復(fù)性較為理想的擴增曲線STD<0.2

2.熔解曲線為非單一峰

這個可能的原因有以下幾點:

① 非特異性擴增

可以根據(jù)設(shè)計原則設(shè)計新的引物,可通過梯度 PCR 對引物退火溫度進行優(yōu)化

② 出現(xiàn)引物二聚體,引物為非特異性引物

引物設(shè)計不合理導(dǎo)致的引物二聚體在熔解曲線內(nèi)峰值一般位于75℃左右,如該峰顯著請按照以下方面進行優(yōu)化:

(A)優(yōu)化擴增條件,可設(shè)置梯度Tm,摸索最佳的Tm值

(B)引物濃度太高,適當(dāng)降低引物濃度

(C)可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體

③ 模板有基因組污染

重新制備cDNA模板即可

3.Ct值出現(xiàn)過晚

① PCR產(chǎn)物太長

PCR產(chǎn)物不宜太長,一般100-50bp即可

② cDNA模板降解

重新制備模板,重復(fù)實驗

③ 擴增效率極低

優(yōu)化反應(yīng)條件,嘗試三步法擴增程序,或者重新設(shè)計引物

④ 反應(yīng)體系中存在PCR反應(yīng)抑制劑

加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實驗

⑤ cDNA模板濃度低

減少稀釋度重復(fù)實驗

4.內(nèi)參基因Ct值正常,目的基因Ct值出現(xiàn)較晚

內(nèi)參基因Ct值正常,說明試劑及操作步驟無誤。目的基因Ct值出現(xiàn)較晚,可能原因為:

① 目的基因表達量偏低--重新富集RNA

② 目的基因引物擴增效率低:

將模板進行梯度稀釋,以確定引物的擴增效率

降低退火溫度

重新設(shè)計引物

5.擴增曲線異常,如“S”型曲線

1)反應(yīng)體系引起的擴增曲線不光滑---擴增效率偏差(過高或過低)

A. 擴增效率過高

出現(xiàn)非特異擴增或引物二聚體:反應(yīng)體系內(nèi)模板濃度太高以及模板核酸質(zhì)量較差可能導(dǎo)致出現(xiàn)抑制PCR反應(yīng)的現(xiàn)象。在絕對定量時表現(xiàn)擴增效率大于110%。

解決方案:

① 去除模板濃度最高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果效率重新回到110%以下,則分析良好;

② 對目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線,一般用克隆該基因的質(zhì)粒做梯度稀釋,或用PCR 產(chǎn)物做梯度稀釋,然后做定量擴增,通過曲線評估反應(yīng)效率。絕對定量有效的擴增效率在90%-110%;

③ 重新純化模板,去除模板中存在的潛在抑制物。切記應(yīng)延長干燥時間,以去除乙醇沉淀過程中的乙醇,或采用另外的純化柱加入洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。

B. 擴增效率過低

主要表現(xiàn)在試劑濃度不適(主要是引物、鎂離子和Taq DNA聚合酶),尤其是在多重實驗中,引物對Tm差異超過5°C 以及熱循環(huán)條件不合適的情況下,試管中各種同源物質(zhì)的競爭作用可造成反應(yīng)效率低下。絕對定量表現(xiàn):擴增效率<90%。

解決方案:對上述因素逐一排除后進行調(diào)整優(yōu)化實驗體系。

C. 個別擴增曲線異常

如個別擴增曲線突然驟降:反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡,由于溫度升高后氣泡破裂,使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。

解決方案:進行擴增反應(yīng)之前要仔細檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。

2)儀器設(shè)置不當(dāng)引起的曲線異常

基線設(shè)置不當(dāng),如擴增曲線斷裂或下滑(基線的終點值大于Ct 值)。減小基線終點(Ct 值- 4),重新分析數(shù)據(jù);

A.基線范圍和閾值設(shè)置不當(dāng)

基線范圍和閾值都是人為設(shè)定的參數(shù)。二者一般由儀器自動默認為合適值。在對同一程序中的多種試劑盒或化學(xué)劑進行評估時,經(jīng)常出現(xiàn)閾值設(shè)置不當(dāng)造成不同組別數(shù)據(jù)的擴增曲線差異:軟件自動選擇的閾值更適合平臺更高的曲線,這將導(dǎo)致數(shù)據(jù)組中的Ct值出現(xiàn)偏差,因為其最佳閾值比此值更低。因此,需對每個數(shù)據(jù)組進行獨立研究,這樣才能根據(jù)具體情形選擇最佳閾值;

B.Rox 添加不當(dāng)

表現(xiàn)為擴增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù),需校正參比染料。

6.絕對定量時標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

① 加樣誤差

加大模板稀釋倍數(shù),提高加樣體積

② 標(biāo)準(zhǔn)品降解

重新制備標(biāo)準(zhǔn)品,重復(fù)實驗

③ 模板濃度太高

增加模板稀釋倍數(shù)

7.絕對定量中通過以下參數(shù)對qPCR結(jié)果加以判定

A.相關(guān)系數(shù)(R2):>0.98,越接近1,結(jié)果可信度越高。R>0.99 或R2>0.98;

B.標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率:-3— -3.5,100%擴增效率對應(yīng)的斜率是-3.32;

C. PCR 擴增效率(E):90%-110%,越接近1,越理想。其對應(yīng)的斜率為-3.58 至-3.10。效率= 10(-1/斜率)-1;

D.檢測靈敏度確認:35Cycles 內(nèi)可得到好的定量結(jié)果,如果采用SYBR 檢測方法,30cycles 內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增;

E. NO template control (NTC)確認:35cycles 內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生;

F. 重復(fù)性:STD<0.2。


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