Real-Time PCR (qPCR)常見問題及解決方案
Real Time PCR(qPCR)，即實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)，是一種利用熒光染劑檢測每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法技術(shù)，是常規(guī)PCR的衍生反應(yīng)。主要是通過熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析。因其具有靈敏、特異、精確以及使用簡便等優(yōu)點，現(xiàn)已發(fā)展成為分子生物學(xué)研究中的重要工具。
常用術(shù)語
首先先定義幾個術(shù)語先以確保澄清事實。
基本概念
1.1 實時定量PCR的簡寫
建議實時定量PCR (quantitative real-time PCR) 應(yīng)當(dāng)簡寫為qPCR，反轉(zhuǎn)錄PCR (reverse transcription–qPCR) 應(yīng)當(dāng)簡寫為RT-qPCR。用RT-PCR簡寫表示qPCR可以引起混亂，并且與傳統(tǒng)RT-PCR的平常應(yīng)用不符。
1.2 內(nèi)參基因
內(nèi)參基因應(yīng)當(dāng)指的是參照基因(reference genes)，而不是管家基因(housekeeping genes)。
1.3 TaqMan探針
TaqMan探針應(yīng)指的是水解探針(hydrolysis probes)。
1.4 FRET probe
FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針)指的是一種機制，基于2個熒光基團的電子激發(fā)狀態(tài)之間的相互作用的基礎(chǔ)上的發(fā)光/淬火。LightCycler型探針指的是雙雜交探針(dual hybridization probes) 。
1.5 定量 quantification
牛津英語詞典只列出了定量(quantification)，非定量(non-quantification)，因quantification是恰當(dāng)?shù)摹?/p>
1.6 Cq
現(xiàn)在文獻中使用的閾值循環(huán)(threshold cycle, Ct)，交點(crossing point, Cp)和分支點(take-off point, TOP) 與PCR反應(yīng)周期中的術(shù)語不一致。這些術(shù)語指的實際上在實時儀器是相同的值，只是不同儀器廠家為了競爭給自己產(chǎn)品的特定定義，不具有準(zhǔn)確性和清晰性。根據(jù)實時定量PCR的標(biāo)記語言的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)(www.rdml.org)，建議同一使用定量循環(huán)(quantification cycle, Cq)這個術(shù)語。
1.7 基線（baseline）
一般默認為3~15個循環(huán)的信號值就是基線（baseline），是由測量的偶然誤差引起的。
基線
1.8 閾值（threshold）
指在擴增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)的適當(dāng)位置上設(shè)定的熒光檢出界限，一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。
閾值
常見問題及解決方案
1.重復(fù)性很差
造成qPCR實驗重復(fù)性差的原因有以下幾點：
① 移液槍不準(zhǔn)，加樣不準(zhǔn)確
這種情況下，我們可以更換性能更好的移液槍，擴大反應(yīng)體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中
② 定量PCR儀在不同位置溫度不一樣
這個需要定期校準(zhǔn)定量PCR儀
③ qPCR預(yù)混液未混合均勻
使用前應(yīng)充分混勻qPCR預(yù)混液
注：重復(fù)性較為理想的擴增曲線STD<0.2
2.熔解曲線為非單一峰
這個可能的原因有以下幾點：
① 非特異性擴增
可以根據(jù)設(shè)計原則設(shè)計新的引物，可通過梯度 PCR 對引物退火溫度進行優(yōu)化
② 出現(xiàn)引物二聚體，引物為非特異性引物
引物設(shè)計不合理導(dǎo)致的引物二聚體在熔解曲線內(nèi)峰值一般位于75℃左右，如該峰顯著請按照以下方面進行優(yōu)化：
（A）優(yōu)化擴增條件，可設(shè)置梯度Tm，摸索最佳的Tm值
（B）引物濃度太高，適當(dāng)降低引物濃度
（C）可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體
③ 模板有基因組污染
重新制備cDNA模板即可
3.Ct值出現(xiàn)過晚
① PCR產(chǎn)物太長
PCR產(chǎn)物不宜太長，一般100-50bp即可
② cDNA模板降解
重新制備模板，重復(fù)實驗
③ 擴增效率極低
優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設(shè)計引物
④ 反應(yīng)體系中存在PCR反應(yīng)抑制劑
加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實驗
⑤ cDNA模板濃度低
減少稀釋度重復(fù)實驗
4.內(nèi)參基因Ct值正常，目的基因Ct值出現(xiàn)較晚
內(nèi)參基因Ct值正常，說明試劑及操作步驟無誤。目的基因Ct值出現(xiàn)較晚，可能原因為：
① 目的基因表達量偏低--重新富集RNA
② 目的基因引物擴增效率低：
將模板進行梯度稀釋，以確定引物的擴增效率
降低退火溫度
重新設(shè)計引物
5.擴增曲線異常，如“S”型曲線
1）反應(yīng)體系引起的擴增曲線不光滑---擴增效率偏差（過高或過低）
A. 擴增效率過高
出現(xiàn)非特異擴增或引物二聚體：反應(yīng)體系內(nèi)模板濃度太高以及模板核酸質(zhì)量較差可能導(dǎo)致出現(xiàn)抑制PCR反應(yīng)的現(xiàn)象。在絕對定量時表現(xiàn)擴增效率大于110%。
解決方案：
① 去除模板濃度最高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果效率重新回到110%以下，則分析良好；
② 對目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，一般用克隆該基因的質(zhì)粒做梯度稀釋，或用PCR 產(chǎn)物做梯度稀釋，然后做定量擴增，通過曲線評估反應(yīng)效率。絕對定量有效的擴增效率在90%-110%;
③ 重新純化模板，去除模板中存在的潛在抑制物。切記應(yīng)延長干燥時間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇，或采用另外的純化柱加入洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。
B. 擴增效率過低
主要表現(xiàn)在試劑濃度不適（主要是引物、鎂離子和Taq DNA聚合酶），尤其是在多重實驗中，引物對Tm差異超過5°C 以及熱循環(huán)條件不合適的情況下，試管中各種同源物質(zhì)的競爭作用可造成反應(yīng)效率低下。絕對定量表現(xiàn)：擴增效率＜90%。
解決方案：對上述因素逐一排除后進行調(diào)整優(yōu)化實驗體系。
C. 個別擴增曲線異常
如個別擴增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。
解決方案：進行擴增反應(yīng)之前要仔細檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。
2）儀器設(shè)置不當(dāng)引起的曲線異常
基線設(shè)置不當(dāng)，如擴增曲線斷裂或下滑（基線的終點值大于Ct 值）。減小基線終點(Ct 值- 4)，重新分析數(shù)據(jù);
A.基線范圍和閾值設(shè)置不當(dāng)
基線范圍和閾值都是人為設(shè)定的參數(shù)。二者一般由儀器自動默認為合適值。在對同一程序中的多種試劑盒或化學(xué)劑進行評估時，經(jīng)常出現(xiàn)閾值設(shè)置不當(dāng)造成不同組別數(shù)據(jù)的擴增曲線差異：軟件自動選擇的閾值更適合平臺更高的曲線，這將導(dǎo)致數(shù)據(jù)組中的Ct值出現(xiàn)偏差，因為其最佳閾值比此值更低。因此，需對每個數(shù)據(jù)組進行獨立研究，這樣才能根據(jù)具體情形選擇最佳閾值;
B.Rox 添加不當(dāng)
表現(xiàn)為擴增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù)，需校正參比染料。
6.絕對定量時標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳
① 加樣誤差
加大模板稀釋倍數(shù)，提高加樣體積
② 標(biāo)準(zhǔn)品降解
重新制備標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)實驗
③ 模板濃度太高
增加模板稀釋倍數(shù)
7.絕對定量中通過以下參數(shù)對qPCR結(jié)果加以判定
A.相關(guān)系數(shù)（R2）：＞0.98，越接近1，結(jié)果可信度越高。R＞0.99 或R2＞0.98；
B.標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：-3— -3.5，100%擴增效率對應(yīng)的斜率是-3.32；
C. PCR 擴增效率（E）：90%-110%，越接近1，越理想。其對應(yīng)的斜率為-3.58 至-3.10。效率= 10(-1/斜率)-1；
D.檢測靈敏度確認：35Cycles 內(nèi)可得到好的定量結(jié)果，如果采用SYBR 檢測方法，30cycles 內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增；
E. NO template control （NTC）確認：35cycles 內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生；
F. 重復(fù)性:STD＜0.2。
