熒光定量PCR——qPCR的原理及應(yīng)用
qPCR的英文全名是Real-timeQuantitative PCR Detecting System。即實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)，也叫實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)，簡稱qPCR。
上世紀八十年代Cetus Corporation公司的化學(xué)家Kary Mullis發(fā)明了PCR，如今DNA擴增技術(shù)儼然已經(jīng)成為了生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。三十多年以來，人們?yōu)榱私鉀Q研究中出現(xiàn)的新問題新需求，不斷對這一經(jīng)典技術(shù)進行改良。從經(jīng)典PCR、實時定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR，PCR技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。如今PCR技術(shù)早已走出實驗室，在遺傳學(xué)鑒定和疾病診斷中發(fā)揮著巨大的作用，在越來越廣闊的領(lǐng)域里煥發(fā)著新的活力。
終點PCR是最原始、最簡單的PCR方法，如今仍在被我們廣泛使用。使用者只能在PCR反應(yīng)結(jié)束之后，通過凝膠電泳、毛細管電泳等方法對產(chǎn)物進行檢測。終點PCR本身是無法定量的，因為該反應(yīng)產(chǎn)出的DNA量不一定能反映最初情況。舉例來說，不同樣品和序列的擴增效率是有差異的。
PCR的反應(yīng)過程：
傳統(tǒng)PCR電泳結(jié)果：
（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
因此，研究者們克服了PCR定量分析的挑戰(zhàn)——實時定量PCR（qPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或熒光探針（比如TaqMan），人們可以通過監(jiān)控PCR過程中的熒光強度比較多個樣品的DNA水平。
在qPCR中使用插入性DNA染料，隨著PCR循環(huán)的連續(xù)進行，這種染料的熒光強度會不斷增強，從而可以使人們對反應(yīng)中的DNA進行定量。利用熒光信號的變化，實時監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)中的每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。
qPCR的特點
·靈敏度高
·特異性強
·全封閉PCR過程，無需后續(xù)處理
·及時反饋擴增過程，摒棄重點數(shù)據(jù)，更適用于定量
·定量范圍寬，可達10個數(shù)量級，無需稀釋樣品
·可實現(xiàn)一管多檢
·儀器自動分析，更快獲得結(jié)果
qPCR的原理
·什么是Ct值？
PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。
·Ct值的重現(xiàn)性
Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性。
簡單來說，模板DNA量越多，熒光達到閾值的循環(huán)次數(shù)越少，即Ct值越?。籐og濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知拷貝數(shù)的標準品可做出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。
qPCR定量分析，有絕對定量和相對定量兩種。
·絕對定量：精確計算初始反應(yīng)的模板濃度（DNA/RNA）
——病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)
——轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)
·相對定量：計算初始反應(yīng)模板的相對含量
——差異表達分析
——芯片評估
——轉(zhuǎn)基因生物的檢測
——基因型檢測
qPCR常用的熒光標記
·非特異性熒光標記
——SYBR Green I
——EvaGreen
——LC Green
·特異性熒光標記
——TaqMan
——Molecular Beacon
——Amplisensor
qPCR的應(yīng)用
·基因擴增
·擴增特異性分析
·基因定量分析
·基因檢測
·基因分型
·SNP分析
·RFLP多態(tài)性分析
·單/多基因表達研究
·高通量基因表達譜研究
目前qPCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥食品等行業(yè)，運用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、藥物研究、腫瘤的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動物疫病檢測等。
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