如何設(shè)計(jì)PCR引物(二)
上回說到如何尋找保守序列，經(jīng)過隆地熊我一番羅嗦，七七八八也該知道了些。當(dāng)然，要想做到爐火純青，各位小白還得勤加練習(xí)。本回隆地熊我就要進(jìn)入正題了，不然對(duì)不起這圖文題目。在做PCR引物設(shè)計(jì)前，首先得了解引物設(shè)計(jì)的基本原則。根據(jù)網(wǎng)上資料匯總（主要來自生物谷、生物秀、小木蟲、百度文庫等，特此一并感謝，具體不再詳細(xì)注明，如有異議，請(qǐng)聯(lián)系號(hào)主更改或刪除，隆地熊我不負(fù)任何責(zé)任，坑死你個(gè)懶鬼號(hào)主）和個(gè)人心得，現(xiàn)一并總結(jié)如下。
PCR引物設(shè)計(jì)基本原則：
1. 設(shè)計(jì)PCR引物前要明白三個(gè)設(shè)計(jì)初衷：
（1）引物要跟模板緊密結(jié)合；
（2）引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在
（3）引物不能在別的非目的位點(diǎn)引起DNA聚合反應(yīng)（即錯(cuò)配）。
為實(shí)現(xiàn)這三個(gè)初衷，設(shè)計(jì)引物需要考慮很多因素，如引物長度（primerlength）、產(chǎn)物長度（productlength）、序列Tm值（meltingtemperature）、ΔG值（internalstability）、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformation and hairpin）、錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)（falsepriming site）、引物及產(chǎn)物GC 含量（composition），有時(shí)還要對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制酶切點(diǎn)，引進(jìn)突變等。
2. 以使用Oligo 軟件分析設(shè)計(jì)引物為例（個(gè)人認(rèn)為Oligo軟件是最為專業(yè)的PCR引物設(shè)計(jì)軟件），進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)遵循的基本原則有：
引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)至其延伸溫度大于74℃，即Taq 酶的最適延伸溫度。
引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的堿基一般不用A（3’端堿基序列最好是G、C、CG、GC），因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。另外引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)至PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR 影響不大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。
引物的GC含量一般為40-60%，以45-55%為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導(dǎo)至引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5’端增加多個(gè)A或T；而如果A-T比例過高，則同樣在5’端增加多個(gè)G或C。完全沒有必要復(fù)雜地去計(jì)算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。
引物所對(duì)應(yīng)模板序列的Tm 值最好在72℃左右。（Tm 值曲線以選取72℃附近為佳，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)），至少要在55-80℃之間。
ΔG值（自由能）反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對(duì)較低，且不要超過9（ΔG值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。3′末端雙鏈的ΔG是0~ -2kcal/mol時(shí)，PCR產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，隨著其絕對(duì)值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在-6時(shí)只有40%、到-8時(shí)少于20%、而-10時(shí)接近于0。
可能的錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯(cuò)誤引發(fā)率高，錯(cuò)誤引發(fā)的引發(fā)率一般不要高過100，如此可保證不出現(xiàn)非目的產(chǎn)物的假帶。但對(duì)于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為450以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為130，并且不好找其他更合適的引物，那么這對(duì)引物也是可以接受的。
Frq 曲線為Oligo6新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片斷存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用Frq 值相對(duì)較低的片斷。
引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)至PCR 正常反應(yīng)不能進(jìn)行，與二聚體相關(guān)的一個(gè)參數(shù)是堿基的分布，3’端的連續(xù)GGG或CCC 會(huì)導(dǎo)至錯(cuò)誤引發(fā)。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其ΔG為-3 kcal/mol的自身互補(bǔ)引物也可以得到不錯(cuò)的結(jié)果，但是如果它的3′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時(shí)就很麻煩，即會(huì)引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。當(dāng)然，如果發(fā)夾環(huán)在5′末端對(duì)反應(yīng)就沒有多大的影響了。
以公式（4×G/C + 2×A/T-5）計(jì)算Tm值，即退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應(yīng)的退火溫度。4-6℃的差別似乎對(duì)PCR產(chǎn)量影響不大。最好，保證每個(gè)引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范圍內(nèi)。
要知道，更重要的因素是模板與穩(wěn)定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因?yàn)镈NA的解鏈溫度也取決于它的長度，所以有的研究者喜歡設(shè)計(jì)很長，而不求它很穩(wěn)定的引物。可是，引物太長就難以避免形成二聚體和自身互補(bǔ)，因此，一般還是不用為好。如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500 bp，選用短的（16~18 mer）的引物；若產(chǎn)物長5 kb，則用24 mer的引物。有人用20~23 mer引物得到40 kb的產(chǎn)物。
在DNA測序和PCR中最好用5′末端穩(wěn)定（如GC含量較多），而3′末端不太穩(wěn)定（如AT含量較多）的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng)。這就是基于引物內(nèi)部穩(wěn)定性的經(jīng)驗(yàn)之談。其3′末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應(yīng)中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的堿基與非靶位點(diǎn)堿基所形成的配對(duì)的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會(huì)產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應(yīng)，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對(duì)，只憑借其3′末端與靶序列任何位點(diǎn)的牢固配合就可以引發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。無論如何，寡核苷酸3′末端最后5個(gè)核苷酸的穩(wěn)定性小于-9kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3′末端越不穩(wěn)定，假引發(fā)的可能性越低。
如果用3′末端低穩(wěn)定性的引物，反應(yīng)的最適退火溫度范圍會(huì)不尋常的寬。這就可以不經(jīng)過事先的最佳化實(shí)驗(yàn)就能在最佳條件下進(jìn)行反應(yīng)。
引物的唯一性：為了放大單個(gè)的、專一性DNA片段，選用的引物序列就應(yīng)當(dāng)是唯一的，即在模板中沒有重復(fù)序列。如果用哺乳動(dòng)物基因組序列作為模板，可以用Alu序列或其他短重復(fù)元件來核對(duì)想用的引物的互補(bǔ)性。由此也可知，應(yīng)當(dāng)避免使用同寡聚物（如-AAAAAA-）和二核苷酸重復(fù)（如-ATATAT-）。
引物和產(chǎn)物的Tm值不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。定下引物的Tm值范圍之后即可定下引物的長度范圍。
對(duì)引物的修飾一般是增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)參考載體的限制酶識(shí)別序列確定，常常對(duì)上下游引物修飾的序列選用不同限制酶的識(shí)別序列，以有利于以后的工作。值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件較差，比如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)至找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；有時(shí)PCR產(chǎn)物要作為克隆對(duì)象插入到載體中表達(dá)，因此PCR引物設(shè)計(jì)的可選擇度很低。遇到這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件，這時(shí)，使用自動(dòng)搜索引物及正確地評(píng)價(jià)引物可使研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)心中有數(shù)。在設(shè)計(jì)克隆PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低，這種PCR需要靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測就不應(yīng)要求太高。
上述十四條原則值得你細(xì)細(xì)評(píng)味，如果都能理會(huì)并用于實(shí)踐的話，設(shè)計(jì)高手就一定會(huì)是你。能設(shè)計(jì)出一對(duì)效果非常好的PCR引物，仍然是能找到好工作的。比如說羅氏的PCR診斷試劑盒，少則數(shù)千，多則上萬，靠的是什么？明白人一看就知道是引物。乖乖，你買任何一種病原診斷試劑盒，能看得到引物序列嗎？不能，所以嘛，小白們，這就是未來的價(jià)值所在哦。好好去鉆研吧。
