漫談單細胞測序及其臨床應(yīng)用
一、概述
隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，細胞群體的研究已不再能滿足科研需求。單細胞測序解決了用組織樣本測序或樣本少時無法解決的細胞異質(zhì)性難題，為科學(xué)家研究解析單個細胞的行為、機制、與機體的關(guān)系等提供了新方向。單細胞測序正在成為科研熱點。
二、單細胞測序倍受青睞的原因
人們最初以為一個細胞類群是均質(zhì)的（即各細胞都是相同的）。但是經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)這個細胞類群其實是異質(zhì)的，在表象和功能上都可以區(qū)分為不同的細胞亞群。繼續(xù)深入研究后發(fā)現(xiàn)細胞亞群也是異質(zhì)的，如此循環(huán)往復(fù)不斷細分。直到今天，我們已經(jīng)知道：即使來源相同的單個細胞，由于隨機生物過程和環(huán)境擾動的原因，彼此在許多方面也存在差異，即細胞的異質(zhì)性。另外，細胞的一切功能，都是由遺傳物質(zhì)的載體，DNA，經(jīng)過復(fù)雜的調(diào)控機制表達出mRNA后，再合成出蛋白質(zhì)而實現(xiàn)的。如按生物學(xué)功能及生物標志物對細胞進行區(qū)分，推向極致就是按單個細胞之間的基因組和（或）轉(zhuǎn)錄組差異進行區(qū)分。單細胞測序就是觀測單個細胞之間基因組和轉(zhuǎn)錄組差異的強大技術(shù)手段之一。
三、單細胞測序目前主要的應(yīng)用領(lǐng)域
哪些領(lǐng)域需要把細胞亞群的鑒定精確到單細胞水平呢？
首先，人體的生殖細胞：精子和卵子。它們每個細胞之間都是互不相同的。但由于缺乏先進的技術(shù)手段，我們難以研究它們之間差異的細節(jié)，更難以利用它們之間的差異使人類受益。
生殖細胞研究里程碑式的進展發(fā)生于2012年，單細胞測序技術(shù)的首次應(yīng)用嘗試就是對單精子基因組的研究觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在精子生成的減數(shù)分裂過程中，分別來源于父母的兩條同源染色體之間會發(fā)生重組。所以，每一個精子中的每一條染色體都帶有程度不等的父源和母源DNA成份，這也賦予了后代近乎無限的多樣性。
只攜有單倍體基因組的單個精子都可以測序，那么卵子應(yīng)該也可以測序。由受精卵發(fā)育成的卵裂球、囊胚更應(yīng)該可以測序。自此，一系列單細胞測序技術(shù)在輔助生殖（試管嬰兒）中的應(yīng)用被建立起來，顯著地提高了試管嬰兒成功率，并可避免單基因遺傳病患兒的出生。這是單細胞測序在現(xiàn)實應(yīng)用中走得最快的一個領(lǐng)域。
另一項被人關(guān)注到單細胞層面的重大命題是惡性腫瘤。近期研究發(fā)現(xiàn)，即使是同一塊腫瘤組織里面的腫瘤細胞也各不相同，存在著高度異質(zhì)性。同時，惡性腫瘤難以對付的，諸如侵襲、復(fù)發(fā)、遠程轉(zhuǎn)移等各種特性，其實主要是由數(shù)量上占極少數(shù)的一些腫瘤細胞亞群導(dǎo)至的。通俗地說，一個惡性腫瘤中的極少數(shù)腫瘤細胞比其它同類更‘惡’！有科學(xué)家把這類細胞稱作‘腫瘤干細胞’。
醫(yī)學(xué)科研工作者們在千方百計地尋找藥物和療法克服惡性腫瘤，當然要把矛頭對準這些更‘惡’的罪魁禍首才能事半功倍。但是，這些更‘惡’的腫瘤細胞是跟其它腫瘤細胞混在一起的并且占比很少，如何把它們鑒別出來呢？大家首先想到的是通過細胞表面標志物來區(qū)分，但效果很不理想。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，極大提高了從將近三萬個基因的基因組或轉(zhuǎn)錄組中鑒別‘惡’細胞的能力。而要想精準觀測‘惡’細胞的特征，當然是把他們進行單獨檢測，以避免互相之間的干擾。單細胞測序是最理想的研究手段。
四、單細胞測序的技術(shù)瓶頸
二代測序是一項威力強大的檢測新技術(shù)。將其應(yīng)用于單細胞的檢測，關(guān)鍵難點并不在于測序本身，而在于單細胞中的核酸物質(zhì)太少！少到遠遠不足以直接測序檢測的程度。具體來說，一個單細胞中僅含有大約4 - 6 皮克DNA，而二代測序通常要求百納克級的DNA起始量，二者之間有幾十萬倍的差距！所以，單細胞測序的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸是首先要對單細胞中極微量的DNA進行高質(zhì)量、大幅度的擴增。
全基因組的微量DNA擴增（Whole Genome Amplification，WGA）技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域已有二、三十年的發(fā)展史，但為什么單細胞測序僅僅在幾年前才實現(xiàn)呢？是因為經(jīng)典的WGA技術(shù)原理，比如多重置換擴增（Multiple Displacement Amplification，MDA）、簡并寡核苷酸引物PCR（Degenerate Oligonucleotide Primer PCR，DOP-PCR）等，存在局限性，使其難以高質(zhì)量地實現(xiàn)大幅度的DNA擴增。所以，直到一項新原理的WGA技術(shù)，即多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù)（Multiple Annealing and Looping-based Amplification Cycles，MALBAC）出現(xiàn)后，穩(wěn)定可靠的單細胞測序才實現(xiàn)了技術(shù)突破。
衡量單細胞WGA產(chǎn)物的質(zhì)量有兩個至關(guān)重要的指標：均一性和脫扣（Allele Drop Out，ADO）率。均一性指的是擴增幅度的均勻性。圖1直觀地展示了從兩種WGA方法獲得的擴增產(chǎn)物的均一性差異。在MDA產(chǎn)物中，染色體上有多處位置獲得了巨幅擴增，但也有些位置根本沒有獲得擴增。這樣的擴增效果顯然會給下游檢測帶來麻煩，甚至虛假的結(jié)果。而MALBAC擴增產(chǎn)物的均一性有了很大改進，染色體上的所有位置都得到一定程度的擴增。這樣的擴增產(chǎn)物在下游檢測，特別是在基因（或染色體）拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation，CNV）檢測中效果會好得多。
圖1. 兩種WGA方法擴增產(chǎn)物均一性比較。圖片引自Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.[J]. Science, 2012, 338(6114):1622-1626. 圖中的中文注釋為本文作者后加。
圖2展示了幾種不同WGA產(chǎn)品對單細胞DNA做擴增測序后，觀察（正常人）染色體CNV情況。圖中可見：擴增均一性比較好時（Yikon，基于MALBAC原理），CNV圖中的點比較密集，各染色體(在兩拷貝位置)表現(xiàn)近似一條細線，可以觀察出較細微的CNV變異。而擴增均一性較差時（Qiagen，基于MDA原理），CNV圖中的點比較離散，形成的染色體線條較粗，細微的CNV變異就可能會被淹沒在‘背景噪聲’之中。
圖2. 幾種WGA產(chǎn)品對單細胞DNA做擴增測序后觀察（正常人）染色體CNV的對比。圖片引自Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102
脫扣，指的是不完美的單細胞WGA給下游檢測帶來的另一種風險。圖3直觀地展示了這種風險。因為單細胞擴增的起始模板只有一個拷貝的基因組，也就是說每個位點的擴增起始模板只有兩個分子（因為人是二倍體生物）。一旦在擴增過程中發(fā)生錯誤，后續(xù)檢測就會把一個雜合位點誤認作純合位點（圖3.a）。反之，也會把一個純合位點誤認作雜合位點（圖3.b）。圖3c展示了幾種WGA產(chǎn)品在進行單細胞擴增時脫扣率的對比情況。圖中可見，在這幾種產(chǎn)品中脫扣率最低的約為21%（Yikon），最高的可達76%（Sigma-Aldrich）。
脫扣率在單細胞SNP的檢測中至關(guān)重要，如果脫扣率過高，所得結(jié)果的可靠性就很低。以SNP為依據(jù)的單倍型判斷的可靠性也會很低。這對腫瘤、生殖相關(guān)的檢測都是很不利的。
圖3. 單細胞基因組擴增中的脫扣現(xiàn)象與幾種產(chǎn)品導(dǎo)至的脫扣率。a：單細胞WGA導(dǎo)至的脫扣。b：單細胞WGA導(dǎo)至的假陽性結(jié)果。c：幾種WGA產(chǎn)品單細胞基因組擴增脫扣率的比較。圖片來源：Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102
理想的單細胞全基因組擴增當然是基因組上各位點都得到同等大幅度的擴增，而且脫扣率為零。但很遺憾,現(xiàn)在還沒有哪種技術(shù)能夠做到這一點。另一方面，新型的WGA技術(shù)，比如MALBAC，雖然仍不完美，其單細胞全基因組擴增質(zhì)量已足以滿足部分科研和臨床應(yīng)用需求。事實上，正是因為MALBAC技術(shù)的發(fā)明，前述具有里程碑意義的單精子測序研究才得以實現(xiàn)。
五、單細胞測序的類型與技術(shù)流程
單細胞測序大體上可分為兩類：DNA測序和RNA測序。
DNA測序：以高通量測序觀測基因組DNA水平的各種變化，包括大至染色體小至幾Kb片段水平的拷貝數(shù)擴增或缺失，點突變（SNP），融合，重組等等。
RNA測序：觀測mRNA（轉(zhuǎn)錄組）水平的變化，包括各基因表達產(chǎn)物的剪接情況，各種剪接體的相對占比和絕對數(shù)量等等。
單細胞測序的技術(shù)流程大致包括：
單細胞挑取，可以人工在顯微鏡下操作，也可以使用自動化的分選儀器。
細胞的裂解和DNA擴增。RNA測序在擴增前要有一個逆轉(zhuǎn)錄過程。
擴增產(chǎn)物的建庫，可以有各種建庫方法。建庫步驟也可以與前一步的DNA擴增步驟合二為一。
上機測序，可以有不同讀長、單端或雙端測序等選擇。
數(shù)據(jù)分析，策略與方法因檢測目的不同而異。
從技術(shù)流程上講，兩類單細胞測序的主要差異在于：RNA測序在細胞裂解后，DNA擴增前多了一個逆轉(zhuǎn)錄步驟，先把mRNA轉(zhuǎn)化成cDNA。后續(xù)的擴增、建庫、測序步驟大同小異。最后的數(shù)據(jù)分析步驟依不同的應(yīng)用目的各不相同。
六、單細胞測序的臨床應(yīng)用：現(xiàn)狀與未來
單細胞測序技術(shù)使以前想做但很難做，甚至無法做的科研與臨床應(yīng)用成為現(xiàn)實。其開山之作，單精子的測序研究就很好地展示了這一點。隨后，基于MALBAC擴增技術(shù)的單細胞測序被應(yīng)用于第三代試管嬰兒：胚胎植入前篩查（Pre-implementation Genetic Screen，PGS）與診斷（Pre-implementation Genetic Diagnosis，PGD），成為單細胞測序技術(shù)建立最早，發(fā)展最快的臨床應(yīng)用。
常規(guī)試管嬰兒流程中，胚胎選取的標準主要是顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察，經(jīng)常無法反映胚胎真實質(zhì)量，成為限制試管嬰兒成功率（平均只有40%左右）的瓶頸之一。利用單細胞測序技術(shù)，從各胚胎中分別撿取1 – 3個細胞（圖4. a，b）進行基因組檢測（即PGS），即可判斷哪個胚胎是最優(yōu)質(zhì)的（圖4.c）。將優(yōu)質(zhì)胚胎植入母體即可顯著提高成功受孕的機會。
如果夫婦二人都是某種常染色體隱性單基因遺傳病的缺陷基因攜帶者（比如遺傳性耳聾），或有一方是常染色體顯性或X-連鎖隱性單基因遺傳病患者（比如多發(fā)性骨軟骨瘤、假肥大性肌營養(yǎng)不良），則可以在PGS基礎(chǔ)上，在測序時對各胚胎中父親和（或）母親所攜致病位點的相應(yīng)區(qū)域做詳細檢測（即PGD）。根據(jù)檢測結(jié)果，只將不攜有致病缺陷的胚胎植入母體子宮，即可保證未來嬰兒的健康。PGD技術(shù)不僅避免了遺傳缺陷患兒的出生。更重要的是，從這個嬰兒開始，其家族中導(dǎo)至該疾病的基因缺陷被徹底消除，該遺傳病在其家族中的世代傳遞將被阻斷。
從實驗技術(shù)上講，單細胞測序的本質(zhì)特征是對極微量核酸的測序檢測。所以單細胞測序檢測技術(shù)可以拓展到幾乎所有涉及極微量核酸測序檢測的其它應(yīng)用。比如，在試管嬰兒受精卵成長為囊胚的體外培養(yǎng)過程中會有極微量的胚胎DNA進入培養(yǎng)基，利用MALBAC技術(shù)將這些微量DNA擴增、測序及分析CNV后，可用該結(jié)果來反映對應(yīng)胚胎的CNV情況。 這種方法被稱為無創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(shù)（NICS：Non-invasive Chromosome Screening)。NICS避免了對卵裂球或囊胚的活檢取樣，從而避免了破壞胚胎的風險。
目前，第一例NICS試管嬰兒已經(jīng)健康出生。如果正在進行中的多中心臨床研究表明這一技術(shù)確實有助于提升試管嬰兒成功率，則NICS必將成為未來PGS檢測的發(fā)展方向。
圖4. 胚胎活檢及PGS檢測結(jié)果。a：受精卵培養(yǎng)第三天時從卵裂球中吸取一個細胞活檢。b：受精卵培養(yǎng)第五天時從囊胚外滋養(yǎng)層吸取 3-5個細胞活檢。 c：單細胞測序檢測4個胚胎的染色體的CNV示意圖：只有1號胚胎的染色體正常，可選擇植入母體子宮。
當前，單細胞測序，特別是單細胞RNA測序在腫瘤方面的應(yīng)用基本還處于學(xué)術(shù)科研層面，執(zhí)行諸如鑒定腫瘤細胞亞群，搜尋腫瘤干細胞之類的任務(wù)。與臨床比較接近的一類應(yīng)用是對循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells，CTC）的鑒定。CTC是從惡性腫瘤原發(fā)灶脫落，進入血液循環(huán)的腫瘤細胞，是惡性腫瘤遠程轉(zhuǎn)移的罪魁禍首。CTC的分離鑒定，對惡性腫瘤的早期診斷，伴隨診斷和復(fù)發(fā)診斷均有潛在的重要意義?，F(xiàn)有CTC的鑒定手段多局限于對幾個上皮來源腫瘤表面標志物，如CK，EpCAM的免疫組化檢測和針對8號染色體拷貝數(shù)擴增的FISH檢測。這些標志物檢測的共同缺陷是：它們都只在部分CTC中存在。那些細胞表面不存在這些標志物，或8號染色體數(shù)目沒有發(fā)生異常的CTC必然成為漏網(wǎng)之魚。另外，即使依靠細胞表面標志物檢出了CTC，所能提供的信息最多不過是CTC的數(shù)量，無法回答臨床極為關(guān)注的更多問題，如，腫瘤的原發(fā)灶在哪里？腫瘤對哪種靶向藥物有效或無效？復(fù)發(fā)的腫瘤與原發(fā)腫瘤是否有著相同的藥敏特性等等。理論上說，單細胞測序則可以在一個檢測中回答所有這些問題。當然，真正現(xiàn)實可行的臨床檢測方案尚在襁褓之中，希望在不久的將來有所突破。
單細胞測序的對極微量核酸測序檢測的這一特征，在臨床微生物檢測中的用武之地已受到一定關(guān)注。有些致病菌體外培養(yǎng)困難，生長周期很長（比如，結(jié)核桿菌的培養(yǎng)周期達一個月）。有些甚至尚無法做體外培養(yǎng)（比如梅毒螺旋體）。利用從患者體內(nèi)獲取的極微量細菌，不經(jīng)培養(yǎng)，利用單細胞測序的拓展技術(shù)直接進行感染的早期診斷和耐藥（藥敏）檢測極具臨床價值。
七、當前單細胞測序的技術(shù)局限性和發(fā)展方向
如前所述，目前尚不存ADO率為零，擴增均一度100%的理想的單細胞DNA擴增方法。因此，單細胞DNA測序也就遠非完美。
在某些應(yīng)用中，比如PGD，因為可以有父母樣本、先證者樣本做參考，即使存在一定的ADO率，也可以利用巧妙的技術(shù)策略，將檢測從點突變的觀測轉(zhuǎn)化為對胚胎染色體單倍型的鑒定，從而填補單細胞DNA擴增的不完美，確保檢測結(jié)果的正確性。但在腫瘤相關(guān)的單細胞測序中，比如CTC的測序檢測，很重要的一類檢測是發(fā)現(xiàn)體細胞點突變。此時的檢測目標與細胞染色體的單倍型無關(guān)，沒有可供矯正檢測錯誤的參考，其正確性只能依賴于擴增過程中的低ADO率。
同樣，在某些應(yīng)用中，比如CNV檢測，擴增的不均一性可以用增大測序數(shù)據(jù)量等技術(shù)手段在一定程度上予以彌補。但在另外一些應(yīng)用中，比如單細胞RNA的轉(zhuǎn)錄組測序，對cDNA的不均一擴增所導(dǎo)至的檢測結(jié)果偏倚，即使再大的測序數(shù)據(jù)量也無法糾正。所以，持續(xù)改善單細胞DNA擴增質(zhì)量是進一步拓展單細胞測序技術(shù)應(yīng)用范圍的必然要求。
現(xiàn)有單細胞RNA測序的技術(shù)方法多數(shù)是針對帶有polyA尾巴的mRNA的。對已經(jīng)被廣為關(guān)注的microRNA，lnRNA等的單細胞測序尚沒有建立很有效的方法。同樣，對基因組甲基化和當前受到高度關(guān)注的等位基因之間差異甲基化的單細胞測序檢測技術(shù)也有待發(fā)展。
八、結(jié)語
隨著單細胞擴增技術(shù)的不斷完善及測序手段的不斷進步，我們有理由相信單細胞測序技術(shù)不僅將在生命科學(xué)研究的大海中風生水起, 一展身手，也會給人類對抗疾病、保障健康和提高生命壽命和質(zhì)量帶來很多新的機會。
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