一、標(biāo)本的制作

免疫熒光技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用上主要有直接法和間接法。直接法是在檢測(cè)樣品上直接滴加已知特異性熒光標(biāo)記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。免疫熒光直接法可清楚地觀(guān)察抗原并用于定位標(biāo)記觀(guān)察。間接法是在檢測(cè)樣品上滴加已知的細(xì)菌特異性抗體，待作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體。如研制成的抗沙門(mén)氏菌熒光抗體，用于750例食品樣品的檢測(cè)，結(jié)果表明與常規(guī)培養(yǎng)法的符合率基本一致。

在食品衛(wèi)生檢疫中，熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)標(biāo)本的制作應(yīng)力求保持抗原的完整性，并在洗滌和固定過(guò)程中不發(fā)生溶解或變性。此外，為了便于抗原和抗體接觸形成抗原-抗體復(fù)合物，以及有利于觀(guān)察和記錄，要求制作的標(biāo)本盡量薄，對(duì)標(biāo)本中干擾抗原-抗體反應(yīng)的物質(zhì)應(yīng)充分洗滌除去，以免影響標(biāo)本的觀(guān)察以及結(jié)果的判定。

熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)標(biāo)本的制作方法為：①涂片：先將載玻片通過(guò)火焰3次，冷卻后，挑取被檢材料涂布成直徑約1cm的圓形涂片，如材料太濃，也可將生理鹽水加入被檢材料中，混勻后均勻涂片。涂好后，晾干或以電風(fēng)扇吹干備用；②固定：不同的抗原采用不同的固定劑，一般常用的固定劑為95%～100%乙醇和丙酮，固定的條件溫度為37℃、時(shí)間為3～15min，某些病毒最好以丙酮在-40～20℃下，固定30min，固定后應(yīng)隨即用PBS反復(fù)沖洗，干后即可用于染色。固定的目的是防止標(biāo)本從玻片上脫落，以及去除組織中妨礙抗原抗體結(jié)合的類(lèi)脂質(zhì)。

二、熒光抗體染色方法

1、直接法

直接法是指用特異熒光抗體直接滴加于待檢的標(biāo)本上，由熒光標(biāo)記的抗體與抗原發(fā)生特異結(jié)合（圖1-1）。標(biāo)本中如有相應(yīng)的抗原存在，即與熒光抗體特異性結(jié)合，在鏡下可見(jiàn)有熒光的抗原復(fù)合物。此法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、特異性高。其缺點(diǎn)是檢查每種抗原均需制備相應(yīng)的特異性熒光抗體，且敏感性低于間接法。? ? ? ?

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圖1-1　直接法示意圖

2、間接法

間接法是根據(jù)抗球蛋白試驗(yàn)的原理，用熒光素標(biāo)記抗球蛋白抗體（簡(jiǎn)稱(chēng)標(biāo)記抗抗體）的方法（圖2-2）。間接法的檢測(cè)過(guò)程分為兩步：第一步，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中在37℃下保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體；第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。由于結(jié)合在抗原-抗體復(fù)合物上的熒光素抗體增多，發(fā)出的熒光亮度強(qiáng)，因而其敏感性強(qiáng)。此外，它只需制備一種熒光抗體就可以檢出多種抗原，能用于檢測(cè)多種動(dòng)物的多種抗原-抗體系統(tǒng)，而且能解決一些不易制備動(dòng)物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查。此方法的缺點(diǎn)是易產(chǎn)生非特異性熒光，影響結(jié)果判斷。

?圖2-2　間接法示意圖

三、熒光顯微鏡檢查

標(biāo)本經(jīng)熒光抗體染色后，需要在熒光顯微鏡下觀(guān)察。熒光顯微鏡是免疫熒光化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀(guān)察標(biāo)本的熒光圖像。在熒光顯微鏡檢查時(shí)，首先要選擇好的光源或?yàn)V光片，濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀(guān)察效果的重要條件。激發(fā)濾光片的作用是提供合適的激發(fā)光。根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類(lèi)激發(fā)濾板，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過(guò)，阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)；紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過(guò)；紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過(guò)；最大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達(dá)明色素）可用藍(lán)綠濾板激發(fā)。

熒光顯微鏡檢查的注意事項(xiàng)：①應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查，進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出的強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開(kāi)始觀(guān)察標(biāo)本；②防止紫外光對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；③檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過(guò)90min，超高壓汞燈的發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外光照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過(guò)2～3h；④熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源，天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源；⑤標(biāo)本染色后立即觀(guān)察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)；⑥熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“一”——無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光，“+”——僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光，“++”——可見(jiàn)有明亮的熒光，“+++”——可見(jiàn)耀眼的熒光。

四、免疫熒光技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用

食品免疫檢測(cè)技術(shù)是食品分析檢測(cè)領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，在殘余藥物、殘余農(nóng)藥、有害微生物等的檢測(cè)方面取得了顯著進(jìn)展。免疫檢測(cè)技術(shù)是基于抗原-抗體反應(yīng)的原理對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量定性分析的檢測(cè)方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。下文將以紅細(xì)胞抗體混合熒光抗體染色法對(duì)食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)為例，說(shuō)明免疫熒光抗體在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用。

1、原理

將抗體球蛋白稀釋成2mg/mL，和2%綿羊紅細(xì)胞1∶1混合（混合后血球成1%），再加依文斯蘭2滴（0.1%）。這樣的懸液里和血球表面帶有沙門(mén)氏菌的抗體，加上增菌液，在濕的環(huán)境下使抗原和抗體結(jié)合，其余的雜質(zhì)和非特異的物質(zhì)不與抗體結(jié)合，不易固定在玻片上，易被水沖擊。因此，有特異性的抗原就能滯留在玻璃片上。

紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)鞣化處理后有一定的吸附作用，能將抗體（包括熒光標(biāo)記的抗體）吸附在血球上，使血球呈黃綠色（如在熒光血清中加依文斯蘭可使血球呈紅色），這樣在玻璃片上呈現(xiàn)出清晰的背景，鏡檢時(shí)見(jiàn)到血球后可鑒定特異性細(xì)菌的存在。因?yàn)榇朔ㄓ形娇贵w的作用，所以抗原也不易漏去，這是熒光抗體的優(yōu)點(diǎn)。

2、方法

（1）取10%戊二醛血球懸液0.3mL于10mL刻度離心管中用2mL生理鹽水洗兩次（2500r/min，5min）。將沉淀血球配成2%血球懸液，以1∶20000鞣酸生理鹽水1∶1混合，置37℃水浴中15min鞣化。

（2）將提純的伽馬球蛋白稀釋成2mg/mL，和以上血球1∶1混合。此時(shí)血球?yàn)?%球蛋白，為1mg/mL。

（3）將以上懸液涂于玻片上（每片8點(diǎn)），在酒精燈上用火焰干燥固定后，加被檢的增菌液于涂片點(diǎn)上，37℃濕盒中30min。

（4）沖洗玻片后加沙門(mén)氏菌熒光抗血清，37℃，30min在濕盒染色。

（5）洗片：用間接法洗較好，待干后鏡檢。

3、結(jié)果判定

亮度：

#　表示菌形清晰，亮環(huán)顯著，發(fā)閃亮黃綠色熒光。

+++　表示菌形清晰，亮環(huán)顯著，亮度較強(qiáng)。

++　表示菌形成形，有亮環(huán)，亮度較差。

+　表示菌體可有些形態(tài)，亮環(huán)清楚，熒光微弱。

-　表示無(wú)熒光。

菌量：

#　表示視野中菌體密布。

+++　表示視野中菌體較密。

++　表示視野中菌體稀散。

+　表示視野中僅見(jiàn)個(gè)別菌體或在數(shù)個(gè)視野中僅見(jiàn)個(gè)別少數(shù)菌體。

-表示無(wú)典型菌體。

判定：

+　表示陽(yáng)性。

±　表示可疑，再做第二次染色如仍可疑做常規(guī)。

-　表示陰性。