摘要

????蛋白質(zhì)是細胞功能的主要執(zhí)行者，由于其無法在體外進行擴增，單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相較單細胞基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)而言發(fā)展相對滯后。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可獲得大量細胞蛋白表達的平均值，但忽略了細胞亞型及細胞異質(zhì)性等信息。單細胞水平的蛋白質(zhì)分析有助于闡明細胞不同表型與異質(zhì)性的分子基礎(chǔ)。隨著質(zhì)譜儀的快速發(fā)展，基于質(zhì)譜的方法將單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)推向新的高度。本文綜述了近年來基于液質(zhì)聯(lián)用方法的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)在單細胞挑選、樣品前處理、同位素標簽技術(shù)、肽段分離、質(zhì)譜采集、數(shù)據(jù)分析等方面的研究進展，及其在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，并對未來單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展前景進行了展望。單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進步將為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域提供新的思路和解決方案，并加深我們對人類健康和疾病的理解。

前言

????蛋白質(zhì)是生命活動所必須的生物大分子，決定了細胞的結(jié)構(gòu)和活性[1]，參與和控制所有的細胞過程[2]，是細胞功能的主要執(zhí)行者。1994年，Wilkins[3]?首次提出蛋白質(zhì)組的概念，表示基因組所表達的全部蛋白質(zhì)。作為功能基因組學(xué)的重要支柱，蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運而生，其以蛋白質(zhì)組為研究對象，研究內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的組成成分、修飾狀態(tài)、表達變化、蛋白質(zhì)間相互作用以及蛋白質(zhì)功能等。隨著生物質(zhì)譜、生物信息學(xué)分析等技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)研究在近十年取得了很大進展，已逐漸成為科學(xué)研究中的重要領(lǐng)域，有助于我們從蛋白質(zhì)水平深入認識生命活動和疾病發(fā)生的分子調(diào)控機制。

????過去幾十年，得益于儀器和信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)θ梭w組織中上萬種蛋白質(zhì)進行深度定量分析，這極大地擴展了我們對細胞信號、調(diào)控和代謝通路[4]?的理解。然而，傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)大多是對大量細胞 （大于 10⁶?個） 或組織樣本進行分析，得到的是蛋白質(zhì)表達水平的平均值，忽視了細胞個體對整體的影響，遺失了細胞亞型特異性和細胞異質(zhì)性的關(guān)鍵信息。因此，傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)在稀有細胞群中的應(yīng)用受到了很大的限制，如早期胚胎發(fā)育、免疫激活、癌細胞的異質(zhì)性解析等。單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為上述問題的解決提供了新的思路。

????早在二十年前，科學(xué)家就嘗試利用抗體[5，6]、綠色熒光蛋白 （Green Fluorescent Protein，GFP）[7]?或基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜 （Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）[8]?對單個細胞中的蛋白質(zhì)進行鑒定和定量。然而抗體的可利用性、特異性及成本等問題限制了單細胞蛋白質(zhì)分析技術(shù)的進展。GFP是一種報告基因，可以分析外源表達蛋白的單細胞分布，分析的蛋白的種類也比較受限。MALDI-TOF MS能在單細胞中鑒定到幾十種代謝物、肽段等分子，蛋白鑒定數(shù)量較低，定量準確性較差[9]。近年來，基于液質(zhì)聯(lián)用的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在蛋白質(zhì)的鑒定和定量方面均顯示出較好的優(yōu)勢。

????得益于樣品制備和實驗設(shè)計的創(chuàng)新，2018年， Zhu 和 Budnik 等[10，11]?分別報道了哺乳動物單細胞組學(xué)的研究成果，優(yōu)化了基于液質(zhì)聯(lián)用的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) （見圖1），在單個哺乳動物細胞中鑒定到數(shù)百種蛋白質(zhì)，開啟了真單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新紀元。目前，利用無標記定量技術(shù)[12]?及同位素標簽技術(shù)[13-15]，單個哺乳動物體細胞中可鑒定一千種以上蛋白質(zhì)，幾百個細胞中可鑒定六千種以上蛋白質(zhì)[16]。由于單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展時間較短，雖然已被應(yīng)用于多種細胞和組織研究中，包括單個人體細胞、單個人卵母細胞、顯微切割組織等，但仍然處于起步階段，面臨諸多技術(shù)挑戰(zhàn)。

????單個典型的哺乳動物體細胞包含大約 0.2 ng蛋白質(zhì)，高于當前質(zhì)譜檢測最低檢測限，使得單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜檢測成為可能。樣本制備以及進入質(zhì)譜分析器之前的蛋白分子丟失是制約單細胞蛋白質(zhì)分析能力的關(guān)鍵因素，也對質(zhì)譜的檢測和數(shù)據(jù)分析帶來了挑戰(zhàn)。采用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)的前處理方式、質(zhì)譜采集方法和分析策略，在單個細胞中很難獲得理想的蛋白質(zhì)鑒定效果。比如，Wu 等[17]?發(fā)現(xiàn) 50 μg 蛋白質(zhì)樣品在經(jīng)過多次轉(zhuǎn)移后會損失 15%，而 2 μg 蛋白質(zhì)樣品在多次轉(zhuǎn)移后存在 89% 的損失率。可見相同的處理方式對分析痕量蛋白質(zhì)的影響是無比巨大的。因此，制約單細胞蛋白質(zhì)分析能力的主要挑戰(zhàn)有：（1） 蛋白提取效率和酶切效率； （2） 樣品在前處理過程中的吸附損失；（3） 肽段的分離和離子化效率；（4） 質(zhì)譜采集速度；（5） 數(shù)據(jù)分析策略。

圖1 單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程

????基于質(zhì)譜的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的突破有賴于常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)流程每個環(huán)節(jié)的優(yōu)化，本文將綜述以液質(zhì)聯(lián)用為核心的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)在單細胞挑選、樣品前處理、同位素標簽技術(shù)、肽段分離、質(zhì)譜采集、數(shù)據(jù)分析等方面的研究進展，以及單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。

1 單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究進展

1.1 單細胞挑選

????生物樣本中單個細胞的獲取是單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展的前提。目前，單細胞分選技術(shù)包括熒光激活細胞分選 （Fluorescence-Activated Cell Sort? ing，F(xiàn)ACS）、激光捕獲顯微切割 （Laser Capture Microdissection，LCM） 和 cellenONE 全自動單細胞分選[18]?等。FACS 最早由 Bonner 等[19]?報道，可根據(jù)目標細胞的熒光特性和光散射特性，將其從不同類型的細胞混合物中快速分離，可篩選多達 108?個/ 天，具有高通量[20]?的特點，已被廣泛應(yīng)用于單細胞的分離分析[10]，但 FACS 分選過程中的鞘液壓力會對細胞活性產(chǎn)生一定的損傷[21]。LCM[22]?是一種利用顯微鏡根據(jù)形態(tài)特征識別細胞獲得組織細胞亞群的方法，但該技術(shù)通量較低，不利于大規(guī)模應(yīng)用。相較而言，cellenONE是一種溫和的全自動分選系統(tǒng)，可于數(shù)分鐘內(nèi)實現(xiàn)數(shù)百個細胞的分離，已應(yīng)用在單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中[23，24]。單細胞挑選技術(shù)的不斷成熟，尤其是專用自動化儀器的使用，提高了單細胞挑選的準確性和成功率。

1.2 單細胞蛋白質(zhì)組樣品前處理方法

????單個哺乳動物體細胞所含的蛋白量低至皮克級[25]。因此，在總蛋白量極低、操作步驟繁瑣的情況下，最大限度地減少蛋白質(zhì)損失，并保證蛋白酶對蛋白質(zhì)消化效率是單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備的關(guān)鍵。通常采取的策略包括簡化樣品處理步驟、減少蛋白質(zhì)吸附損失和最小化樣品反應(yīng)體積。

????常規(guī)的 “ 鳥槍法 ” 蛋白質(zhì)組學(xué) （Shotgun Proteomics） 步驟繁瑣，其基本流程是從樣本 （細胞、組織、體液等） 中提取蛋白質(zhì)后，使用酶 （如胰蛋白酶） 酶解成肽段，經(jīng)色譜分離后進行質(zhì)譜分析。中間涉及到蛋白質(zhì)還原、烷基化、酶解等多個步驟。倘若樣品中含有去垢劑如十二烷基硫酸鈉 （Sodium Dodecyl Sulfate，SDS） 或其它與質(zhì)譜不兼容的試劑，還需要對樣品進行純化處理。因而，在整個樣品制備過程中，蛋白質(zhì)和多肽暴露于各種表面，并由于非特異吸附而導(dǎo)致不同程度的損失。

????為了減少樣品處理步驟、減少蛋白質(zhì)吸附損失，研究人員嘗試了各種樣品前處理裝置。Hughes團隊[26]?開發(fā)了一種基于磁珠的單罐固相增強樣品制備 （Single-Pot Solid-Phaseenhanced Sample Prepara? tion，SP3） 方法，將樣品制備的所有過程 （細胞裂解、蛋白質(zhì)酶解、肽標記、純化、分餾和濃縮） 集中在單個反應(yīng)容器中完成。該方法兼容大多數(shù)去垢劑，在5 ng Hela細胞蛋白提取物中可鑒定到200個蛋白質(zhì)[27]。同樣在單個裝置中進行樣品制備的還有 iST （in-StageTip）[28]?和 SOPs-MS （Surfactant-Assisted One-pot Sample Preparation Coupled With Mass Spectrometry） 方法[29]。利用 SOPs-MS 方法可在單個細胞中定量到數(shù)百種蛋白質(zhì)，在小組織切片中 （約20個細胞） 定量約1 200種蛋白質(zhì)。

????減少吸附損失對于痕量蛋白或多肽是至關(guān)重要的。高濃度的胰蛋白酶酶解[30-33]?可以有效減少酶切產(chǎn)物的非特異吸附問題，但過量胰蛋白酶帶來的糜蛋白酶活性會對后續(xù)的肽段分析造成干擾[33]。Li 等[34]?利用強疏水性肽段對 0.2 mL 的普通 EP 管和低吸附 EP 管進行包被處理，將單個 Hela 細胞的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量分別提升了 63% 和 23%。最近， Masuda等[35]?開發(fā)了一種基于羧基包被磁珠和相轉(zhuǎn)移表面活性劑的油包水 （Water Droplet-in-Oil Diges? tion，WinO）樣品前處理方法，可進一步減少蛋白質(zhì)和肽段的吸附損失。該方法將蛋白質(zhì)和肽段的回收率提高了10倍，可在單個細胞中定量到462種蛋白質(zhì)。????

????樣品制備體積小型化，一方面可以降低樣品與容器表面的非特異性結(jié)合減少樣品損失，另一方面可提升蛋白質(zhì)和蛋白酶濃度以提高蛋白酶的酶切效率[36]。Li 等[37]?開發(fā)出了一種油-氣-液滴 （Oil-Air-Droplet，OAD） 芯片，可將反應(yīng)體積縮小至 2 μL。該方法在 100、10 和 1 個 Hela 細胞中分別鑒定到 1 360、192和51個蛋白質(zhì)。Kelly和Zhu的團隊[10]?設(shè)計了一種名為 nanoPOTS （nanodroplet Processing in One Pot for Trace Samples） 芯片的樣品制備裝置，通過在恒溫恒濕環(huán)境中進行樣品制備以最大程度地減少液滴的蒸發(fā)，并可以借助機器人實現(xiàn)自動化[38]。nanoPOTS 芯片可以將樣品制備體積縮小至 200 nL；結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析工具 MaxQuant 的運行間匹配 （Match Between Runs，MBR） 算法，可在 10個與單個Hela細胞中分別鑒定到超過3 000個蛋白質(zhì)與 670 個蛋白質(zhì)[39]。引入的自動化裝置有利于減少批次效應(yīng)，大大節(jié)省人力成本，提高通量。之后以此為基礎(chǔ)改進的N2（Nested nanoPOTS）芯片[23]，進一步將反應(yīng)容器的體積減小至 30 nL，分別在單個 C10、RAW 和 SVEC 細胞中鑒定到 1 735、1 690 和 1 725 個蛋白質(zhì)。此外，通過增加芯片中樣品反應(yīng)容器數(shù)目可有效減少單個芯片的處理時間，同時結(jié)合同位素標簽技術(shù)，可將單細胞通量提高10倍。 Gebreyesus 等[40]?開發(fā)了基于微流控芯片的單細胞集成蛋白質(zhì)組學(xué)芯片 （Single-cell integrated Proteomics Chip，SciProChip），結(jié)合數(shù)據(jù)非依賴性采集 （Data-Independent Acquisition，DIA） 模式，可在單個哺乳動物細胞中鑒定到約1 500種蛋白質(zhì)。

????總之，單蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理方法的優(yōu)化對于減少蛋白質(zhì)樣品損失，提升酶切效率，均有著重要意義。未來高效的自動化樣品制備設(shè)備研發(fā)，樣本制備體系的進一步簡化和效率優(yōu)化，有助于進一步提高單細胞定量蛋白的種類，提高單細胞樣本之間的制備重復(fù)性。

1.3 基于同位素標簽標記的載體增強單細胞蛋白質(zhì)組技術(shù)

????單個細胞樣品的質(zhì)譜檢測時間約為 1-3 小時，極大地限制了單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的高通量分析。 Russell等[41]?率先在單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析上引入同位素標簽 （Tandem Mass Tag，TMT） 技術(shù)，借助載體 （Carrier/Boost） 通道的使用，可有效降低處理過程中的蛋白質(zhì)吸附損失，提升蛋白鑒定數(shù)量，并一定程度上解決了單細胞蛋白質(zhì)組低通量的問題。 Slavov 團隊[11]?由此開發(fā)了質(zhì)譜分析單細胞蛋白質(zhì)組 （Single Cell Proteomics by Mass Spectrometry， SCoPE-MS）技術(shù)，實現(xiàn)了在單個細胞中定量一千種蛋白質(zhì)的可能。Woo 等[23]?將同位素標簽技術(shù)與 nanoPOTS芯片結(jié)合開發(fā)出先進的 N2芯片，該芯片在單個細胞中平均可定量到1 500種蛋白質(zhì)。然而，同位素標簽技術(shù)仍存在部分缺陷，試劑純度不足會導(dǎo)致蛋白質(zhì)定量比例壓縮[42]，載體通道過多亦會影響細胞定量的準確性[14，43]?；谕凰貥撕灅擞浀妮d體策略可以提高單細胞中蛋白質(zhì)的鑒定數(shù)量和通量，但如何解決載體對單細胞蛋白質(zhì)定量的準確性的影響仍需要進一步研究。

1.4 液相色譜肽段分離方法

????肽段的高效分離可降低給定時間內(nèi)進入質(zhì)譜儀的樣品成分的復(fù)雜性，擴大動態(tài)范圍并減少電離抑制，肽段分離和電離的改善是進行超靈敏質(zhì)譜分析的重要條件[44]。目前，大多數(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析采用 75 μm 內(nèi)徑的色譜柱和 300 nL/min 左右的流速[45]。研究表明，更細的色譜柱 （如 20 μm 內(nèi)徑色譜柱） 可以將蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的靈敏度提高 20 倍以上[46]，而液相色譜的流速降至20~40 nL/min時，質(zhì)譜靈敏度亦可獲得顯著提升[47]。Cong 等[48]?采用 20 μm 內(nèi)徑的色譜柱和 20 nL/min 的色譜流速針對單個 Hela 細胞蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)在使用相同的細胞類型、制備方法和質(zhì)譜儀的條件下，更細的色譜柱與更慢的流速使得平均MS/MS衍生鑒定率增加了40% 以上，達到近300個蛋白質(zhì)。此外，多孔層空心柱 （Porous Layer Open Tube，PLOT）[49]、窄孔徑納米色譜柱[48]、毛細管電泳 （Capillary Electrophoresis， CE）[50]?皆可以顯著提高微量樣品中的蛋白質(zhì)鑒定效果。內(nèi)徑更細的高效液相色譜柱和更低的色譜流速能提升單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測靈敏度，但也會帶來實驗操作難度，延長色譜梯度時間，降低分析通量。開發(fā)適用于單細胞樣品的高靈敏度新型色譜柱，是未來的發(fā)展方向。

1.5 質(zhì)譜儀及采集方法

????質(zhì)譜性能的提升驅(qū)動單細胞蛋白組學(xué)的飛速發(fā)展。目前絕大多數(shù)微量樣品的分析都使用了基于 Orbitrap 的高分辨質(zhì)譜檢測器。與 Orbitrap Fusion Lumos 質(zhì)譜儀相比，最新一代的 Orbitrap Eclipse 可使單個 Hela 細胞中鑒定到的肽段和蛋白分別增加 36% 和 20%[48]。最近，離子淌度 （Ion Mobility） 技術(shù)在蛋白質(zhì)質(zhì)譜中的應(yīng)用顯著提升單細胞蛋白質(zhì)的鑒定效率?；谄乒艿碾x子遷移譜 （Ion MobiIity Spectrometry，IMS） 和高場不對稱波形離子遷移譜 （High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry，F(xiàn)AIMS） 可以過濾單電荷物質(zhì)，提高質(zhì)譜對肽段的選擇性[51，52]，以提升單細胞蛋白的鑒定效果[12]。Mann團隊[53]?等聯(lián)合開發(fā)的捕集離子淌度質(zhì)譜 （Trapped Ion Mobility Spectrometry，TIMS） 在微量蛋白和單細胞層面展現(xiàn)了強大功能和廣闊的應(yīng)用前景。

????數(shù)據(jù)依賴采集 （Data-Dependent Acquisition， DDA） 模式是蛋白質(zhì)組肽段鑒定的最常用方法[54]。在該模式下，質(zhì)譜會選擇強度最高的N個離子 （一般10~20個） 進行碎裂并采集二級譜圖。這種方法受限于質(zhì)譜儀掃描速度和檢測靈敏度[55]，不能保證每個前體離子在每次運行中都碎片化，從而在肽段和蛋白質(zhì)鑒定中產(chǎn)生顯著變異。在單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)中，這一缺點被進一步放大，而數(shù)據(jù)非依賴性采集 （Data-Independent Acquisition，DIA） 模式可以克服這一缺點。在DIA中，整個質(zhì)譜掃描范圍被劃分為多個小窗口，這些窗口內(nèi)的所有前體離子都被反復(fù)碎片化[56]，從而可以無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的信息。相比于DDA，DIA可以鑒定復(fù)雜樣品中的低豐度蛋白，極大提升鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目[57]，也已在單個哺乳動物體細胞的蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定中發(fā)揮優(yōu)勢[40]。

????雖然現(xiàn)有的質(zhì)譜儀靈敏度已經(jīng)能用于單細胞蛋白質(zhì)的鑒定，但是很多低豐度表達的蛋白質(zhì)，質(zhì)譜儀仍然無法檢測。未來更高靈敏度質(zhì)譜儀的研發(fā)，能促進單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法的發(fā)展，更好地實現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)的檢測覆蓋度。

1.6 單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法

????對單細胞質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析與優(yōu)化，能幫助我們優(yōu)化單細胞蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定參數(shù)，提升定量準確性、增加蛋白質(zhì)的鑒定效果。 DO-MS （Data-Driven Optimization of Mass Spectrometry）[58]?能夠可視化質(zhì)譜數(shù)據(jù)并幫助確定最佳質(zhì)譜參數(shù)，如洗脫峰采樣和污染水平等；通過增加離子積累時間，可使二級質(zhì)譜分析的離子遞送效率提高 370%。 SCPCompanion （Single-Cell Proteomics Companion）[43]?能夠快速分析單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)并對實驗和儀器參數(shù)進行優(yōu)化，可快速評估單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，推薦儀器和數(shù)據(jù)分析參數(shù)以提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。 SCeptre （Single Cell Proteomics Readout of Expres? sion）[59]?是用于數(shù)據(jù)歸一化的計算工具，可以有效地對數(shù)據(jù)進行標準化，實現(xiàn)細胞聚類。以上幾種工具被用來進行質(zhì)量控制以評估數(shù)據(jù)的準確性和完整性。

????DART-ID （Data-Driven Alignment of Retention Times for Identification）[60]?和 IceR[61]?被用于減少單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)實驗中的缺失值。DART-ID 通過利用肽段保留時間等信息，提高了單細胞蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)量，減少了單細胞定量的缺失值。IceR （Ion current Extraction Re-quantification） 使用離子電流信息進行混合肽段鑒定，與其它方法相比，具有更好的定量精度、準確性、可靠性和數(shù)據(jù)完整性。

????DeepSCP[62]?利用深度學(xué)習(xí)以提高單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的覆蓋率，其通過預(yù)測保留時間來構(gòu)建肽段匹配圖譜 （Peptide-Spectrum Matches，PSMs） 的一系列特征，結(jié)合優(yōu)化的集成學(xué)習(xí)模型預(yù)測 PSM 標簽。通過目標誘餌競爭 （Target-Decoy Competition， TDC） 的方法以可靠地鑒定肽段和蛋白質(zhì)。作為一種方便、低成本的計算框架，DeepSCP有助于單細胞蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定，并促進單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的未來發(fā)展和應(yīng)用。

????目前已有的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的算法、軟件能幫助改善單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的覆蓋率。然而，單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的譜圖解析率仍然不高，譜圖解析率的提升和硬件提升同樣重要，能有力地促進單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。

2 單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用

????目前，單個哺乳動物體細胞可以定量到一千種以上的蛋白質(zhì)，其分析深度與轉(zhuǎn)錄組學(xué)相比仍有一定差距。目前的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用主要集中在細胞分群、細胞異質(zhì)性研究等方面，涉及生殖發(fā)育、細胞分化、免疫、細胞周期等各個領(lǐng)域。非洲爪蟾的卵母細胞直徑約為 1~1.2 mm，肉眼可觀察，易于處理，是研究細胞間異質(zhì)性和胚胎不對稱性的理想模型[63]，其蛋白質(zhì)含量遠多于哺乳動物細胞。 Garcia 等[64]?使用納米流體裝置，結(jié)合 DIA，從非洲爪蟾囊胚單個細胞中檢測出 1 650 種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn) 2細胞階段至8細胞階段差異表達蛋白質(zhì)數(shù)量增加，細胞間異質(zhì)性增加，并揭示了爪蟾胚胎發(fā)育早期的不對稱性。

????相比之下，哺乳動物卵母細胞直徑約為 50~120 μm，人類單個卵細胞的蛋白質(zhì)含量約為100 ng。 Virant-klun 等[65]?利用 SP3 技術(shù)，在單個人類卵母細胞中鑒定出約450個蛋白質(zhì)，并對卵母細胞成熟過程進行深入探究，有助于進一步解析人類卵母細胞生物學(xué)特征、女性不育的分子機理以及胚胎植入前發(fā)育等生物學(xué)過程。Guo 等[32]?優(yōu)化了蛋白質(zhì)裂解和消化條件，對 34 個人體內(nèi)與體外成熟卵母細胞進行單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究，鑒定到2 382種蛋白質(zhì)，揭示了體外成熟卵母細胞具有高度異質(zhì)性，為評估體外成熟對卵母細胞質(zhì)量的影響和研究卵母細胞成熟的分子機制提供了新的見解。針對雌性生殖細胞的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究有助于闡明雌性生殖細胞成熟、發(fā)育的分子機制，幫助我們更好的理解不孕不育的發(fā)病機制，為解決人類不育提供理論基礎(chǔ)。

????單個哺乳動物體細胞蛋白含量約 0.2 ng，進行單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有更大的挑戰(zhàn)。Zhu 等[39]?利用 nanoPOTS 芯片技術(shù)，成功區(qū)分人肺原代細胞中不同細胞類型，篩選鑒定出上皮細胞和間充質(zhì)細胞的蛋白質(zhì)標志物。Schoof 等[59]?利用單細胞蛋白組學(xué)研究原發(fā)性髓系白血病的干細胞分化，對不同分化階段的細胞進行分群及分化軌跡分析，發(fā)現(xiàn)同一細胞類型的蛋白表達呈現(xiàn)異質(zhì)性，為細胞發(fā)育及分化奠定分子基礎(chǔ)。Schulte-Schrepping等[66]?利用單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)對 COVID-19患者血液中的免疫細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)免疫細胞類型的組成發(fā)生改變。Specht團隊[15]?利用開發(fā)的SCoPE2單細胞蛋白質(zhì)組方法聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對巨噬細胞進行深入解析，在分選的 1 490 個單細胞中，鑒定到 3 042個蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性。 Brunner 團隊[53]?結(jié)合自己研發(fā)的單細胞處理平臺與 diaPASEF 技術(shù)，分析了不同細胞周期各單細胞的蛋白表達差異，揭示了細胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子。目前針對哺乳動物體細胞的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)在分析細胞間的差異蛋白、解析細胞間的異質(zhì)性、以及發(fā)現(xiàn)新的細胞亞群方面，已經(jīng)取得了一定的進展。未來隨著技術(shù)的成熟，有望在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮更加重要的作用。

3 總結(jié)和展望

????作為一個新興的領(lǐng)域，隨著質(zhì)譜技術(shù)和樣本制備技術(shù)的快速發(fā)展，單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在近 5 年取得快速進展[10，37，39]。雖然許多學(xué)者已經(jīng)開發(fā)出多種單細胞樣品制備方法，但從獲得生物樣品到質(zhì)譜檢測，仍然存在肽段的吸附丟失等問題，單個哺乳動物細胞中只能鑒定到一千多種蛋白質(zhì)，與單細胞轉(zhuǎn)錄組分析的深度相比，仍有較大的發(fā)展空間。單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在樣品前處理、色譜分離、質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)分析等各個環(huán)節(jié)均可以進一步優(yōu)化，減少樣本損失，提高靈敏度，提升數(shù)據(jù)解析利用率。其次，單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的通量較低。同位素標記技術(shù)大大提高了單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析的通量，但仍遠遠低于單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的測序通量。開發(fā)微流控、自動化裝置等技術(shù)有望進一步提高單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的分析通量，并減少人工操作可能帶來的誤差。此外，開發(fā)出更加適用于單細胞樣品的專用色譜儀、質(zhì)譜儀以及專門用于針對單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)優(yōu)化的算法，也將有力推動單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。

????目前，單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)與單細胞蛋白組學(xué)比較顯示，單細胞蛋白組學(xué)結(jié)果比單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)更穩(wěn)定，兩者具有很好的互補性[53]；多組學(xué)聯(lián)用技術(shù)將是未來科學(xué)研究的重要策略。此外，在蛋白質(zhì)行使功能的過程中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾發(fā)揮了重要作用，開發(fā)新的技術(shù)解析單個細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾信息，也是未來研究的一個重要方向。

????隨著各種相關(guān)方法的不斷完善和成熟，單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將不斷提升，幫助我們從蛋白質(zhì)水平解析細胞的調(diào)控與異質(zhì)性，以及生理學(xué)和病理學(xué)中細胞異質(zhì)性的分子基礎(chǔ)；單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)有助于發(fā)現(xiàn)新的細胞亞群，對疾病進行分型分類，發(fā)現(xiàn)新的疾病亞型，指導(dǎo)臨床疾病精準診療，均具有非常重要的意義?？傊?，單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)一樣，將成為生物醫(yī)學(xué)研究中的重要工具。

參考文獻

[1]TIMP W,TIMP G.Beyond mass spectrometry,the next step in proteomics[J].Sci Adv,2020,6(2):8978-8993.

[2]AEBERSOLD R,MANN M.Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function[J].Nature,2016,537(7620):347-355.

[3]WILKINS M.Proteomics data mining[J].Expert Rev Proteomics,2009,6(6):599-603.

[4]GEDDES-MCALISTER J,PRUDHOMME N,GUTIERREZ GONGORA D,et al.The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in molecular pharming practices[J].Curr Opin Chem Biol,2022,68:102133.

[5]BANDURA D R,BARANOV V I,ORNATSKY O I,et al.Mass cytometry:technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry[J].Anal Chem,2009,81(16):6813-6822.

[6]BENDALL S C,SIMONDS E F,QIU P,et al.Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum[J].Science,2011,332(6030):687-696.

[7]CHALFIE M,TU Y,EUSKIRCHEN G,et al.Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J].Science,1994,263(5148):802-805.

[8]CAPRIOLI R M,FARMER T B,GILE J.Molecular imaging of biological samples:localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS[J].Anal Chem,1997,69(23):4751-4760.

[9]LEVY E,SLAVOV N.Single cell protein analysis for systems biology[J].Essays Biochem,2018,62(4):595-605.

[10]ZHU Y,PIEHOWSKI P D,ZHAO R,et al.Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells[J].Nat Commun,2018,9(1):882-891.

[11]BUDNIK B,LEVY E,HARMANGE G,et al.SCoPEMS:mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation[J].Genome Biol,2018,19(1):161-172.

[12]CONG Y,MOTAMEDCHABOKI K,MISAL S A,et al.Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies > 1000 protein groups per mammalian cell[J].Chem Sci,2020,12(3):1001-1006.

[13]DOU M,CLAIR G,TSAI C F,et al.High-throughput single cell proteomics enabled by multiplex isobaric labeling in a nanodroplet sample preparation platform[J].Anal Chem, 2019, 91(20): 13119-13127.

[14]TSAI C F,ZHAO R,WILLIAMS S M,et al.An improved boosting to amplify signal with isobaric labeling(iBASIL)strategy for precise quantitative single-cell proteomics[J].Mol Cell Proteomics, 2020,19(5):828-838.

[15]SPECHT H,EMMOTT E,PETELSKI A A,et al.Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2[J].Genome Biol,2021,22(1):50-76.

[16]DOU M,ZHU Y,LIYU A,et al.Nanowell-mediated two-dimensional liquid chromatography enables deep proteome profiling of < 1000 mammalian cells[J].Chem Sci,2018,9(34):6944-6951.

[17]WU R,XING S,BADV M,et al.Step-wise assessment and optimization of sample handling recovery yield for nanoproteomic analysis of 1000 mammalian cells[J].Anal Chem,2019,91(16):10395-10400.

[18]BERNHARD P,FEILEN T,ROGG M,et al.Proteome alterations during clonal isolation of established human pancreatic cancer cell lines[J].Cell Mol Life Sci,2022,79(11):561-582.

[19]BONNER W A,HULETT H R,SWEET R G,et al.Fluorescence activated cell sorting[J].Rev Sci Instrum,1972,43(3):404-409.

[20]YANG G,WITHERS S G.Ultrahigh-throughput FACSbased screening for directed enzyme evolution[J].Chembiochem,2009,10(17):2704-2715.

[21]VAN DEN BRINK S C,SAGE F,VERTESY A,et al.Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations[J].Nat Methods,2017,14(10):935-936.

[22]ESPINA V,WULFKUHLE J D,CALVERT V S,et al.Laser-capture microdissection[J].Nat Protoc,2006,1(2):586-603.

[23]WOO J,WILLIAMS S M,MARKILLIE L M,et al.High-throughput and high-efficiency sample preparation for single-cell proteomics using a nested nanowell chip [J].Nat Commun, 2021, 12(1): 6236-6246.

[24]DERKS J,LEDUC A,WALLMANN G,et al.Increasing the throughput of sensitive proteomics by plexDIA[J].Nat Biotechnol,2022,Online ahead of print.

[25]DAI X,SHEN L.Advances and trends in omics technology development[J].Front Med,2022,9:911861-911885.

[26]HUGHES C S,FOEHR S,GARFIELD D A,et al.Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology[J].Mol Syst Biol,2014,(10):757-770.

[27]SIELAFF M,KUHAREV J,BOHN T,et al.Evaluation of FASP,SP3,and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range[J].J Proteome Res,2017,16(11):4060-4072.

[28]ZHANG Y,YANG H,YU Y,et al.Application of nanomaterials in proteomics-driven precision medicine [J].Theranostics,2022,12(6):2674-2686.

[29]TSAI C F,ZHANG P,SCHOLTEN D,et al.Surfactant-assisted one-pot sample preparation for label-free single-cell proteomics[J].Commun Biol,2021,4(1):265-276.

[30]TURIAK L,OZOHANICS O,MARINO F,et al.Digestion protocol for small protein amounts for nanoHPLC-MS(MS)analysis[J].J Proteomics,2011,74(7):942-947.

[31]ZHANG P,GAFFREY M J,ZHU Y,et al.Carrier-assisted single-tube processing approach for targeted proteomics analysis of low numbers of mammalian cells [J].Anal Chem,2019,91(2):1441-1451.

[32]GUO Y,CAI L,LIU X,et al.Single-cell quantitative proteomic analysis of human oocyte maturation revealed high heterogeneity in in Vitro-matured oocytes[J].Mol Cell Proteomics,2022,21(8):100267-100282.

[33]TOTH G,SUGAR S,BALBISI M,et al.Optimized sample preparation and microscale separation methods for high-sensitivity analysis of hydrophilic peptides[J].Molecules,2022,27(19):6645-6651.

[34]LI S Q,SU K C,ZHUANG Z K,et al.A simple,rapid,and practical method for single-cell proteomics based on mass-adaptive coating of synthetic peptides[J].Sci Bull,2022,67(6):581-584.

[35]MASUDA T,INAMORI Y,FURUKAWA A,et al.Water droplet-in-oil digestion method for single-cell proteomics [J].Anal Chem,2022,94(29):10329-10336.

[36]XU K,LIANG Y,PIEHOWSKI P D,et al.Benchtop-compatible sample processing workflow for proteome profiling of < 100 mammalian cells[J].Anal Bioanal Chem,2019,411(19):4587-4596.

[37]LI Z Y,HUANG M,WANG X K,et al.Nanoliter-scale oil-air-droplet chip-based single cell proteomic analysis [J].Anal Chem,2018,90(8):5430-5438.

[38]PAN J Z,FAN C,ZUO Z Q,et al.Lab at home:a promising prospect for on-site chemical and biological analysis[J].Anal Bioanal Chem,2022,Online ahead of print.

[39]ZHU Y,CLAIR G,CHRISLER W B,et al.Proteomic analysis of single mammalian cells enabled by microfluidic nanodroplet sample preparation and ultrasensitive nanoLC-MS[J].Angew Chem Int Ed Engl,2018,57(38):12370-12374.

[40]GEBREYESUS S T,SIYAL A A,KITATA R B,et al.Streamlined single-cell proteomics by an integrated microfluidic chip and data-independent acquisition mass spectrometry[J].Nat Commun,2022,13(1):37-49.

[41]RUSSELL C L,HESLEGRAVE A,MITRA V,et al.Combined tissue and fluid proteomics with Tandem Mass Tags to identify low-abundance protein biomarkers of disease in peripheral body fluid:an alzheimer's disease case study[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2017,31(2):153-159.

[42]CHEN X,SUN Y,ZHANG T,et al.Quantitative proteomics using isobaric labeling:a practical guide[J].Genomics Proteomics Bioinformatics,2021,19(5):689-706.

[43]CHEUNG T K,LEE C Y,BAYER F P,et al.Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics[J].Nat Methods,2021,18(1):76-83.

[44]SLAVOV N.Single-cell protein analysis by mass spectrometry[J].Curr Opin Chem Biol,2021,60:1-9.

[45]WILSON S R,OLSEN C,LUNDANES E.Nano liquid chromatography columns[J].Analyst,2019,144(24):7090-7104.

[46]GREGUS M,KOSTAS J C,RAY S,et al.Improved sensitivity of ultralow flow LC-MS-based proteomic profiling of limited samples using monolithic capillary columns and FAIMS technology[J]. Anal Chem,2020,92(21):14702-14712.

[47]SPECHT H,SLAVOV N.Transformative opportunities for single-cell proteomics[J].J Proteome Res,2018,17(8):2565-2571.

[48]CONG Y,LIANG Y,MOTAMEDCHABOKI K,et al.Improved single-cell proteome coverage using narrowbore packed nanoLC columns and ultrasensitive mass spectrometry[J].Anal Chem, 2020, 92(3): 2665-2671.

[49]XIE H,DING X.The intriguing landscape of single-cell protein analysis[J].Adv Sci,2022,9(12):2105932-2105950.

[50]ZHANG Z,HEBERT A S,WESTPHALL M S,et al.Production of over 27000 peptide and nearly 4400 protein identificationsbysingle-shotcapillary-zoneelectrophoresis-mass spectrometry via combination of a very-low-electroosmosis coated capillary,a third-generation electrokinetically-pumped sheath-flow nanospray interface,an orbitrap fusion lumos tribrid mass spectrometer, and an advanced-peak-determination algorithm[J].Anal Chem,2018,90(20):12090-12093.

[51]BEKKER-JENSEN D B,MARTINEZ-VAL A,STEIGERWALD S,et al.A compact quadrupole-orbitrap mass spectrometer with FAIMS interface improves proteome coverage in short LC gradients[J].Mol Cell Proteomics,2020,19(4):716-729.

[52]CINTRON-DIAZ Y L,GOMEZ-HERNANDEZ M E,VERHAERT M,et al.Spatially resolved neuropeptide characterization from neuropathological formalin-fixed,paraffin-embedded tissue sections by a combination of imaging MALDI FT-ICR mass spectrometry histochemistry and liquid extraction surface analysis-trapped ion mobility spectrometry-tandem mass spectrometry[J].J Am Soc Mass Spectrom,2022,33(4):681-687.

[53]BRUNNER A D,THIELERT M,VASILOPOULOU C,et al.Ultra-high sensitivity mass spectrometry quantifies single-cell proteome changes upon perturbation[J].Mol Syst Biol,2022,18(3):10798-10812.

[54]COX J.Prediction of peptide mass spectral libraries with machine learning[J].Nat Biotechnol,2022,Online ahead of print.

[55]MICHALSKI A,COX J,MANN M.More than 100,000 detectable peptide species elute in single shotgun proteomics runs but the majority is inaccessible to data-dependent LC-MS/MS[J].J Proteome Res,2011,10(4):1785-1793.

[56]GUAN S,TAYLOR P P,HAN Z,et al.Data dependent-independent acquisition(DDIA)proteomics[J].J Proteome Res,2020,19(8):3230-3237.

[57]LIN L,ZHENG J,YU Q,et al.High throughput and accurate serum proteome profiling by integrated sample preparation technology and single-run data independent mass spectrometry analysis[J].J Proteomics,2018,174:9-16.

[58]HUFFMAN R G,CHEN A,SPECHT H,et al.DO-MS:data-driven optimization of mass spectrometry methods [J].J Proteome Res,2019,18(6):2493-2500.

[59]SCHOOF E M,FURTWANGLER B,URESIN N,et al.Quantitative single-cell proteomics as a tool to characterize cellular hierarchies[J].Nat Commun,2021,12(1):3341-3355.

[60]CHEN A T,FRANKS A,SLAVOV N.DART-ID increases single-cell proteome coverage[J].PLoS Comput Biol,2019,15(7):1007082-1007111.

[61]KALXDORF M,MULLER T,STEGLE O,et al.IceR improves proteome coverage and data completeness in global and single-cell proteomics[J].Nat Commun,2021,12(1):4787-4801.

[62]WANG B,WANG Y,CHEN Y,et al.DeepSCP:utilizing deep learning to boost single-cell proteome coverage[J].Brief Bioinform,2022,23(4):1-15.

[63]ZHANG Z,DUBIAK K M,SHISHKOVA E,et al.High-throughput,comprehensive single-cell proteomic analysis of xenopus laevis embryos at the 50-cell stage using a microplate-based MICROFASP system[J].Anal Chem,2022,94(7):3254-3259.

[64]SAHA-SHAH A,ESMAEILI M,SIDOLI S,et al.Single cell proteomics by data-independent acquisition to study embryonic asymmetry in xenopus laevis[J].Anal Chem,2019,91(14):8891-8899.

[65]VIRANT-KLUN I,LEICHT S,HUGHES C,et al.Identification of maturation-specific proteins by single-cell proteomics of human oocytes[J].Mol Cell Proteomics,2016,15(8):2616-2627.

[66]SCHULTE-SCHREPPING J,REUSCH N,PACLIK D,et al.Severe COVID-19 is marked by a dysregulated myeloid cell compartment[J].Cell,2020,182(6):1419-1440.

《生物醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化》作者：霍子安，郭曰帥，王月，司徒成昊，郭雪江，生殖醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京 211166；

文章編號:2096-8965(2022)04-0085-09

DOI:10.12287/j.issn.2096-8965.20220411

• 

  2023年遨游系列專題——蛋白組學(xué)研究進展與技術(shù)應(yīng)用