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Science ：以菌治瘤

2023.10.20

　　盡管嵌合抗原受體（CAR）-T細(xì)胞在治療血液惡性腫瘤方面已取得顯著成功，但實(shí)體瘤的有效靶向作用仍然有限。與血液惡性腫瘤細(xì)胞普遍表達(dá)抗原靶標(biāo)CD19不同，實(shí)體瘤上的腫瘤相關(guān)抗原具有異質(zhì)性和缺乏特異性的特點(diǎn)，一方面靶向治療的選擇壓力會(huì)引起抗原陰性復(fù)發(fā)，使不表達(dá)目的抗原的癌細(xì)胞持續(xù)增殖，另一方面會(huì)導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞誤傷健康組織，且T細(xì)胞的浸潤(rùn)性較差。研究表明細(xì)菌可以選擇性地定殖于免疫豁免腫瘤核心，并能在缺氧的微環(huán)境下生存，一些小組便利用攜帶特定“貨物”的工程菌作為瘤內(nèi)生物反應(yīng)器，雖然對(duì)于大量實(shí)體瘤患者而言是安全的，但還未在臨床試驗(yàn)中證實(shí)其有效性。

　　近日，來(lái)自哥倫比亞大學(xué)的Tal Danino團(tuán)隊(duì)在Science雜志上發(fā)表了一篇題為 Probiotic-guided CAR-T cells for solid tumor targeting 的文章，他們開發(fā)了一個(gè)益生菌引導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞 (ProCAR) 系統(tǒng)，簡(jiǎn)而言之，可定植于腫瘤的益生菌釋放能被CAR-T細(xì)胞識(shí)別的靶標(biāo)以標(biāo)記腫瘤組織，募集CAR-T細(xì)胞進(jìn)而誘發(fā)原位裂解，該系統(tǒng)已在人類和小鼠癌癥的多種異種移植和同源模型中證明是安全有效的。此外，他們還進(jìn)一步設(shè)計(jì)了多功能益生菌，可釋放趨化因子以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的募集和治療反應(yīng)，展示了工程細(xì)菌作為CAR-T細(xì)胞療法輔助裝置的強(qiáng)大效力。

　　CAR-T難以對(duì)付實(shí)體瘤的一個(gè)主要原因就在于瘤上的腫瘤相關(guān)抗原（TAA），為了創(chuàng)建一個(gè)不依賴于TAA的CAR-T系統(tǒng)，作者改造了大腸桿菌Nissle1917（EcN），簡(jiǎn)而言之，在該系統(tǒng)中，EcN可以在腫瘤微環(huán)境（TME）中增殖至臨界密度后裂解釋放CAR靶標(biāo)（ProTag）至胞外空間，該靶標(biāo)包含一個(gè)可結(jié)合腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的肝素結(jié)合域（heparin binding domain, HBD）以標(biāo)記腫瘤，同時(shí)包含一個(gè)可被工程改造后的CAR-T細(xì)胞識(shí)別的GFP蛋白（定義為GFP CAR-T 細(xì)胞, GFP28z），從而實(shí)現(xiàn)在抗原未知的情況下對(duì)腫瘤的追蹤（下圖）。

　　圖1. EcN介導(dǎo)的CAR-T靶向殺傷腫瘤示意圖。

　　在體外測(cè)試中，該系統(tǒng)表現(xiàn)出對(duì)人類不同癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性，為了測(cè)試其在體內(nèi)的效果，作者在遞送GFP CAR-T細(xì)胞48小時(shí)前，對(duì)荷瘤免疫缺陷（NSG）小鼠單次瘤內(nèi)注射攜帶ProTag的或?qū)φ站?，僅ProTag菌株能介導(dǎo)有效的抗腫瘤反應(yīng)，顯著減緩腫瘤生長(zhǎng)并提高小鼠生存率，且未產(chǎn)生明顯副作用。人類三陰性乳腺癌（TNBC）由于缺乏雌激素和孕激素受體及HER2表達(dá)，對(duì)現(xiàn)有的靶向療法沒有反應(yīng)，為了進(jìn)一步評(píng)估ProCAR系統(tǒng)對(duì)抗原的不依賴性，作者測(cè)試了其在人類TNBC小鼠模型中的療效，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了持久的抗腫瘤功效，植入后70天沒有觀察到腫瘤生長(zhǎng)，此外，在另一皮下接種SKOV3腫瘤的小鼠模型中也觀察到類似表現(xiàn)。

　　盡管已證明ProCAR系統(tǒng)對(duì)免疫功能缺陷小鼠腫瘤抑制有效，但在功能性免疫系統(tǒng)背景下的效果卻未知。為此，作者在攜帶皮下結(jié)直腸癌的免疫活性小鼠中進(jìn)一步測(cè)試該系統(tǒng)，向腫瘤注射ProTag菌株后注射自體GFP CAR-T細(xì)胞，同樣能產(chǎn)生顯著的抗腫瘤功效。通過對(duì)腫瘤及腫瘤引流淋巴結(jié)分離的細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析發(fā)現(xiàn)，CD69在腫瘤浸潤(rùn)性CD8+和CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)顯著增加，且激活的CD40+ MHCII+單核細(xì)胞頻率增加，提示瘤內(nèi)益生菌和活化的CAR-T細(xì)胞之間合作可以增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)，最終帶來(lái)全身性抗腫瘤益處。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一株能釋放人CXCL16（驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞遷移的趨化因子）激活突變體（CXCL16K42A）的菌株（ProCombo），并在荷瘤小鼠體內(nèi)驗(yàn)證了該菌株對(duì)T細(xì)胞的募集能力及新系統(tǒng)對(duì)腫瘤的控制效果，且不會(huì)引起額外的腫瘤外毒性跡象?？偟膩?lái)說(shuō)，這項(xiàng)工作證明經(jīng)改造的益生菌與CAR-T細(xì)胞合作可以實(shí)現(xiàn)不依賴于腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤靶向和抑制效果。

　　針對(duì)這項(xiàng)研究，來(lái)自美國(guó)波士頓大學(xué)的Eric M. Bressler和Wilson W. Wong在同期雜志上發(fā)表了題為Engineered bacteria guide CAR T cells to tumors-T cells and bacteria are engineered to work together to find and destroy tumor cells 的觀點(diǎn)文章，他們指出與小鼠相比，人類對(duì)內(nèi)毒性更為敏感，盡管有研究表明靜脈注射減毒鼠傷寒沙門氏菌是安全的且能實(shí)現(xiàn)腫瘤定植，但在高劑量下會(huì)出現(xiàn)菌血癥和其他毒性。因此，ProCAR 系統(tǒng)向臨床轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵問題在于在不破壞細(xì)菌活力和腫瘤定植的前提下規(guī)避革蘭氏陰性細(xì)菌的潛在毒性。此外，需要注意的是，人類腫瘤的尺寸往往比小鼠腫瘤大20至40倍，未來(lái)的研究將需要確認(rèn)ProTag在不同尺寸腫瘤中的擴(kuò)散距離。總體來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)工作是治療異質(zhì)性“冷”腫瘤潛在方法的重要概念驗(yàn)證。