? ? 1、絕對定量分析

? ? 這是熒光定量PCR技術(shù)的直接應(yīng)用，可用于檢測病毒及細(xì)菌的濃度！
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? ? 2、相對定量分析及實(shí)驗(yàn)方案

? ? 基因表達(dá)(gene expression)是指細(xì)胞在生命過程中,把儲存在DNA順序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯,轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子. 遺傳物質(zhì)DNA首先要把所攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)錄成為信使RNA（mRNA）,攜帶遺傳信息的mRNA從細(xì)胞核進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中與核糖體結(jié)合，在核糖體中mRNA攜帶的遺傳信息被翻譯成為多肽，多肽經(jīng)過進(jìn)一步加工后變成蛋白質(zhì)，至此遺傳物質(zhì)DNA完成了表達(dá)過程。期間的轉(zhuǎn)錄過程是基因表達(dá)中非常重要的調(diào)節(jié)步驟，所轉(zhuǎn)錄的mRNA的多少直接影響著相關(guān)最終蛋白質(zhì)的多少，所以通過對細(xì)胞內(nèi)某條基因mRNA含量多少的分析，就能大致判斷出該條基因的表達(dá)是否活躍。

? ? 研究基因表達(dá)的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少?；虮磉_(dá)調(diào)控研究中，由于RNA純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會用一些看家基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。所謂的看家基因即內(nèi)參基因，是指在各生理階段表達(dá)量恒定的基因，也稱奢侈基因，該基因表達(dá)一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作參照，常用的內(nèi)參基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。因此，在做基因表達(dá)調(diào)控分析時(shí)至少要做兩個(gè)基因，目的基因和一個(gè)看家基因。

? ? 假定在1生理時(shí)期，X基因的表達(dá)量為X1；其內(nèi)參基因表達(dá)量為Y1；X1/Y1就將1生理時(shí)期的取樣、RNA提取、純化、反轉(zhuǎn)錄等過程的所有偏差均一化了；同樣在2生理時(shí)期，X2/Y2就將2生理時(shí)期的取樣、RNA提取、純化、反轉(zhuǎn)錄等過程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能較為真實(shí)的反應(yīng)在1、2生理時(shí)期，X基因的變化情況。

? ? 常用的相對定量方法主要有兩種，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和Delta-delta Ct法。

? ? 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

? ? 所謂的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法就是對內(nèi)參基因和所研究的目的基因都做絕對定量，然后將各生理階段的目的基因的量和內(nèi)參基因的量相除，得出一個(gè)比值；最后再將不同生理階段所得的比值相除，最終得出目的基因在不同生理階段的表達(dá)變化。

? ? 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法思路直觀、條理清晰，最大限度的避免了實(shí)驗(yàn)的誤差，是一種很好的分析方法。

? ? Delta-delta Ct法

? ? 此法是經(jīng)定量的數(shù)學(xué)原理推導(dǎo)而來

? ? 該方法直接利用看家基因來校正樣品初始量，但同時(shí)默認(rèn)兩個(gè)基因擴(kuò)增效率一致，而并非真實(shí)擴(kuò)增情況的反映，因此實(shí)驗(yàn)條件需要嚴(yán)格優(yōu)化，并且總會存一定的偏差。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，必需對目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。軟件會自動(dòng)給出兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的R值、擴(kuò)增效率等信息，如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即M值的差小于0.1，表明兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率已非常接近，那么后續(xù)實(shí)驗(yàn)中就可以用此法進(jìn)行相對定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無法用該方法進(jìn)行相對定量分析。此時(shí)的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，使兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量方法。

? ? 3、SNP檢測分析

? ? 基因組DNA是生物體各種生理、病理性狀的物質(zhì)基礎(chǔ)。人類眾多個(gè)體的基因組序列的一致性高達(dá)99%以上，但個(gè)體之間各種性狀的差異仍然很大，包括對疾病的易感性、對同一疾病治療藥物的反應(yīng)性等。在同一生物種群中明顯存在兩種以上不同的遺傳性狀，而且出現(xiàn)頻率較高，稱為遺傳的多態(tài)性(polymorphism)，而遺傳物質(zhì)DNA的多態(tài)性如RFLP、STR、ABO血型、HLA和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是個(gè)體間差異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。
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? ? SNPs是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸位置上存在轉(zhuǎn)換(C與T互換，在其互補(bǔ)鏈上則為G與A互換)或顛換(C與A，G與T，C與G，A與T互換)等變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500——1000個(gè)堿基對中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。

? ? 通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的，轉(zhuǎn)換的發(fā)生率總是明顯高于其它幾種變異，具有轉(zhuǎn)換型變異的SNP約占2/3，其它幾種變異的發(fā)生幾率相似。轉(zhuǎn)換的幾率之所以高，可能是因?yàn)镃pG二核苷酸上的胞嘧啶殘基是人類基因組中最易發(fā)生突變的位點(diǎn)，其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。

? ? 在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(cSNP)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。

? ? 從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種：一種是同義cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP(non-synonymous cSNP),指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。

? ? 根據(jù)已知的SNP位點(diǎn)變化設(shè)計(jì)出兩種不同的探針，一種和野生型完全匹配，一種和突變型完全匹配；每一個(gè)樣品都平行的做兩次熒光定量PCR檢測，一次添加野生型探針，一次添加突變型探針；針對特定的SNP位點(diǎn)，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。由于SNP位點(diǎn)堿基的不同，所以擴(kuò)增結(jié)果也有差異。探針序列和模板序列完全匹配時(shí)，擴(kuò)增曲線正常；探針序列和模板不完全匹配時(shí)，擴(kuò)增曲線不起跳，或者熒光量很弱Ct值很大；當(dāng)樣品為雜合子時(shí)，由于樣品中含有和兩種探針序列匹配的模板，所以此時(shí)擴(kuò)增曲線幾乎完全重合。這種差異就反映在擴(kuò)增曲線上。如下圖：
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