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食品中病原性大腸艾希氏菌的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)

2020.8.18

實(shí)驗(yàn)方法原理 正常情況下,大腸艾希氏菌不致病,而且還能合成維生素B和K,生產(chǎn)大腸菌素,對機(jī)體有利。但當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或大腸艾希氏菌侵入腸外組織或器官時(shí),可作為條件性致病菌而引起腸道外感染。有些血清型可引起腸道感染,已知的引起致病性大腸艾希氏菌有四類,即產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌、出血性大腸艾希氏菌、腸道侵襲性大腸艾希氏菌和腸道致病性大腸艾希氏菌,后者主要引起新生兒的腹瀉。帶菌的牛和豬是傳播本菌引起食物中毒的重要原因,人的帶菌亦可污染食品,引起中毒。

實(shí)驗(yàn)材料 大腸艾希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株食品檢樣白鼠大腸艾希氏菌診斷血清產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌診斷血清產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌LT和ST酶標(biāo)診斷試劑盒抗LT抗毒素

試劑、試劑盒 多粘菌素B紙片硫椰汞溶液伊文思藍(lán)溶液革蘭氏染色液肉湯麥康凱瓊脂伊紅美藍(lán)瓊脂三糖鐵瓊脂克氏雙糖鐵瓊脂糖發(fā)形管賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基尿素瓊脂氰化鉀培養(yǎng)基蛋白陳水靛基質(zhì)試劑半固體瓊脂Honda氏產(chǎn)毒肉湯E1ek氏培養(yǎng)基氧化酶試劑

儀器、耗材 天平均質(zhì)器乳缽溫箱水浴顯微鏡離心機(jī)酶標(biāo)儀細(xì)菌濃度比濁管廣口瓶三角燒瓶平皿試管吸管橡膠乳頭載玻片酒精燈金屬匙玻璃棒鎳鉻絲接種棒試管架試管簍冰箱注射器刀子剪子鑷子硝酸纖維素濾膜


實(shí)驗(yàn)步驟


一、增菌


樣品采集后應(yīng)盡快檢驗(yàn)。以無菌操作稱取檢樣25 g,加在225 mL營養(yǎng)肉湯中,以均質(zhì)器打碎1 min或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量,接種乳糖膽鹽培養(yǎng)基,以測定大腸菌群MPN,其余的移入500 mL廣口瓶內(nèi),于36土1 ℃培養(yǎng)6 h。挑取1環(huán),接種于1管30 mL腸道菌增菌肉場內(nèi),于42 ℃培養(yǎng)18 h。


二、分離


將乳糖發(fā)酵陽性的乳糖膽鹽發(fā)酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)瓊脂平板;污染嚴(yán)重的檢樣,可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍(lán)平板,于36土1 ℃培養(yǎng)18 h一 24 h,觀察菌落。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落,同時(shí)也要注意乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。


三、生化試驗(yàn)


1. ?自鑒別平板上直接挑取數(shù)個(gè)菌落分別接種三糖鐵(TSl)或克氏雙糖鐵瓊脂(KI)。同時(shí)將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、半固體、pH 7.2尿素、瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)物均在36 ℃培養(yǎng)過夜。


2. ?TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸,底層產(chǎn)酸,H2S陰性,KCN陰性和尿素陰性的培養(yǎng)物為大腸艾希氏菌。TSI底層不產(chǎn)酸,或H2S、KCN、尿素有任一項(xiàng)為陽性的培養(yǎng)物,均非大腸艾希氏菌。必要時(shí)做氧化酶試驗(yàn)或革蘭氏染色鏡檢。


四、血清學(xué)試驗(yàn)


1. ?假定試驗(yàn)


挑取經(jīng)生化試驗(yàn)證實(shí)為大腸艾希氏菌的瓊脂培養(yǎng)物,用致病性大腸艾希氏菌、侵襲性大腸艾希氏苗、產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌多價(jià)O血清和出血性大腸艾希氏苗O157,血清做玻片凝集試驗(yàn)。當(dāng)與某一種多價(jià)O血清凝集時(shí),再與該多價(jià)血清所包含的單價(jià)O血清做試驗(yàn)。如與某一個(gè)單價(jià)O血清呈現(xiàn)強(qiáng)凝集反應(yīng),即為假定試驗(yàn)陽性。


2. ?證實(shí)實(shí)驗(yàn)


制備O抗原懸液,稀釋至與MacFarland?3號比濁管相當(dāng)?shù)臐舛?。原效價(jià)為1:160—1:320的O血清,用0.%鹽水稀釋至1:40。稀釋血清與抗原懸液在10 mm×75 mm試管內(nèi)等量混合,做試管凝集試驗(yàn)。混勻后放于50 ℃水浴箱內(nèi),經(jīng)16 h后觀察結(jié)果。如出現(xiàn)凝集,可證實(shí)為該O抗原。


五、腸毒素試驗(yàn)


1. ?酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測LT和ST


(1)產(chǎn)毒培養(yǎng)


將試驗(yàn)菌株和陽性及陰性對照菌株分別接種于0.6 mLCAYE培養(yǎng)基內(nèi),37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。加入20000 IU/ml的多粘菌素B0.05 mL,于37 ℃培養(yǎng)1h,4000 r/min離心15 min,分離上清液,加入0.1%硫柳汞0.05 ml,于4 ℃保存待用。


(2)LT檢測方法(雙抗體夾心法)


包被:先在產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌CT和ST酶標(biāo)診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管,加入包被液0.5 ml,混勻后全部吸出于3.6ml包被液中混勻,以每孔100 μl量加入到40孔聚苯乙烯硬反應(yīng)板中,第一孔留空作對照,于4 ℃冰箱濕盒中過夜。


洗板:將板中溶液甩去,用洗滌液I洗3次,甩盡液體,翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板,在吸水紙上拍打,去盡孔中殘留液體。


封閉:每孔加100 μL封閉液,于37 ℃水浴中l(wèi) h。


洗板:用洗滌液II洗3次,操作同上。


加樣本:每孔分別加多種試驗(yàn)菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)液100 μl,37 ℃水浴中l(wèi) h。


洗板:用洗滌液II洗3次,操作同上。


加酶標(biāo)抗體:先在酶標(biāo)LT抗體管中加0.5 ml稀釋液,混勻后全部吸出于3.6 ml稀釋液中混勻,每孔加100 μl,37 ℃水浴中1 h。


洗板:用洗滌液II洗3次,操作同上。


酶底物反應(yīng):每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100 μl,室溫下避光作用5 min~10 min,加入終液50 μl。


結(jié)果判定:以酶標(biāo)儀在波長492 nm下測定吸光度0D值,待測標(biāo)本OD值大于陰性對照3倍以上為陽性,目測顏色為桶黃色或明顯高于陰性對照為陽性。


(3)ST檢測方法(抗原競爭法)


包被:先在包被用ST抗原管中加0.5 ml包被液,混勻后全部吸出于1.6 ml包被液中混勻,以每孔50 μl加入于40孔聚苯乙烯軟反應(yīng)板中。加液后輕輕敲板,使液體布滿孔底。第一孔留空作對照,置4 ℃冰箱濕盒中過夜。


洗板:用洗滌液I洗3次,操作同上。


封閉:每孔加100 μl封閉液,37 ℃水浴比。


洗板:用洗滌液II洗3次,操作同上。


加樣本及ST單克隆抗體:每孔分別加各試驗(yàn)菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)液50μl、稀釋的ST單克隆抗體50 μl(先在ST單克隆抗體管中加0.5 mL稀釋液,混勻后全部吸出于1.6 ml稀釋液中,混合),37 ℃水浴1 h。


洗板:用洗滌液II洗3次,操作同上。


加酶標(biāo)記兔抗鼠1 g復(fù)合物:先在酶標(biāo)記免抗鼠1 g復(fù)合物管中加0.5 mL稀釋液,混勻后全部吸出于3.6 mL稀釋液中混勻,每孔加100 μl,37 ℃水浴1 h。


洗板:用洗滌液II洗3次,操作同上。


酶底板反應(yīng):每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100 μl,室溫下避光5 min~10 min,再加入終止液50 μl。


結(jié)果判定:以酶標(biāo)儀在波長492 nm下測定吸光度OD值;目測無色或明顯淡于陰性對照為陽性。


2. ?雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測LT


將被檢菌株按五點(diǎn)環(huán)形接種于E1ek氏培養(yǎng)基上。以同樣操作,共做兩份,于36 ℃培養(yǎng)48 h。在每株菌苔上放多粘菌素B紙片,于36 ℃經(jīng)5 h~6 h,使腸毒素滲入瓊脂中,在距五點(diǎn)環(huán)形菌苔各5 mm處的中央,挖一個(gè)直徑4 mm的圓孔,并用一滴瓊脂墊底。在平板的中央孔內(nèi)滴加LT抗毒素30 μl,用已知產(chǎn)LT和不產(chǎn)毒菌作對照,經(jīng)15 h~20 h觀察結(jié)果。在菌斑和抗毒素孔之間出現(xiàn)白色沉淀帶者為陽性,無沉淀帶者為陰性。


3. ?乳鼠灌胃試驗(yàn)檢測ST


將被檢菌株接種于Honda氏產(chǎn)毒肉湯內(nèi),于36 ℃培養(yǎng)24 h,以3000 r/min離心30 min,取上清液經(jīng)薄膜濾器過濾,加熱60 ℃30 min,每mL濾液內(nèi)加入2%伊文思藍(lán)溶液0.02 mL。將此濾液用塑料小管注入1日齡一4日齡的乳鼠胃內(nèi)0.1 mL,同時(shí)接種3只~4只,禁食3h~4 h后用三氯甲烷麻醉,取出全部腸管,稱量腸管(包括積液)重量及剩余體重。腸管重量與剩余體重之比大于0.09為陽性,0.07—0.09為可疑。


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