NHS與胺反應(yīng)的交聯(lián)劑化學(xué)特性
NHS 酯反應(yīng)化學(xué)
NHS 酯是通過羧酸鹽分子的碳二亞胺活化形成的反應(yīng)基團(tuán)（參閱碳二亞胺交聯(lián)劑化學(xué)）。NHS 酯活化的交聯(lián)劑和標(biāo)記化合物在生理至弱堿性條件下（pH 7.2 至 9）與伯胺反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。反應(yīng)釋放出 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）。
化學(xué)偶聯(lián)伯胺的 NHS 酯反應(yīng)方案。R 代表具有 NHS 酯活性基團(tuán)的標(biāo)記試劑或交聯(lián)劑的一端；P 代表含有靶官能基團(tuán)（即伯胺）的蛋白質(zhì)或其他分子。
NHS 酯水解與伯胺反應(yīng)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。水解速率隨緩沖液 pH 值的增加而增加，低濃度蛋白質(zhì)溶液中的交聯(lián)效率降低。在 pH 7.0 和 0°C 下，NHS-酯化合物的水解半衰期為 4 至 5 小時(shí)。在 pH 8.6 和 4°C 下，該半衰期降低至 10 分鐘。在不含伯胺的水溶液中，NHS 酯水解的程度可以在 260 至 280 nm 處測(cè)量，因?yàn)?NHS 副產(chǎn)物在該范圍內(nèi)吸收峰。
NHS-酯交聯(lián)反應(yīng)最常在室溫或 4°C 下于 pH 7.2-8.5 的磷酸鹽、碳酸鹽-碳酸氫鹽、HEPES 或硼酸鹽緩沖液中進(jìn)行（0.5-4 小時(shí)）。與伯胺緩沖液（例如 Tris，TBS）不相容，因?yàn)樗鼈儠?huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。但是，在某些步驟中，結(jié)合步驟結(jié)束時(shí)可添加 Tris 或甘氨酸緩沖液以淬滅（停止）反應(yīng)。
低濃度疊氮化鈉（≤3 mM 或 0.02％）或硫柳汞（≤0.02 mM 或 0.01％）通常不會(huì)明顯干擾 NHS-酯反應(yīng)，但濃度較高時(shí)會(huì)產(chǎn)生干擾。不純的甘油和高濃度甘油（20-50％）也會(huì)降低反應(yīng)效率。
Sulfo(磺基)-NHS 酯除了在 N-羥基琥珀酰亞胺環(huán)上含有磺酸根（–SO3）外，其他部分與 NHS 酯相同。該帶電基團(tuán)對(duì)整個(gè)化學(xué)反應(yīng)沒有影響，主要用于增加含有它們的交聯(lián)劑的水溶性。此外，帶電基團(tuán)可防止Sulfo-NHS 交聯(lián)劑穿過細(xì)胞膜，使它們可用于細(xì)胞表面交聯(lián)。
Sulfo-NHS 酯反應(yīng)方案用于與伯胺發(fā)生化學(xué)結(jié)合。R 代表具有Sulfo-NHS 酯反應(yīng)性基團(tuán)的標(biāo)記試劑或交聯(lián)劑一端；P 代表含有靶官能基團(tuán)（即伯胺，–NH2）的蛋白質(zhì)或其他分子。
NHS-酯試劑的溶解度隨緩沖液組成和分子結(jié)構(gòu)其余部分（例如，間隔臂）的物理性質(zhì)發(fā)生變化。許多非磺化 NHS-酯試劑是非水溶性的，必須首先溶解在可與水混溶的有機(jī)溶劑中（例如 DMSO 和 DMF）才能添加至水性反應(yīng)混合物中。因此，與非水溶性NHS-酯發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)通常需要在水性反應(yīng)中加入 0.5-10％ 的有機(jī)溶劑。
NHS 與Sulfo-NHS 交聯(lián)劑的對(duì)比。DSS 和 BS3（磺基-DSS）的化學(xué)結(jié)構(gòu)。DSS 不能直接溶于水，一旦溶解便會(huì)穿過整個(gè)細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生交聯(lián)。BS3 是水溶性的（在常規(guī)工作濃度下），帶電后不能穿細(xì)胞膜內(nèi)，而將 BS3 交聯(lián)局限在完整細(xì)胞表面上。
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