2020版《中國藥典》三部--生物制品國家標準物質制備和標定
生物制品的生產(chǎn)通常以微生物或人/動物源的細胞、組織和體液等為起始原材料，其制備過程或制劑中可能添加人或動物來源的原材料或輔料，這些起始原材料、原材料或輔料潛在的病毒污染是影響產(chǎn)品安全性的關鍵因素。
本通則是對生物制品病毒安全性控制的基本要求，旨在控制生物制品的病毒安全性風險，保證產(chǎn)品質量。本通則適用于本版藥典生物制品定義范圍的相關產(chǎn)品。涉及與傳染性海綿狀腦?。═SE）等相關的傳染因子，還應符合國家其他相關法規(guī)要求。
—、病毒安全性控制的一般原則
?。ㄒ唬╋L險評估
生物制品理論上都存在病毒污染的潛在風險，但不同類型的生物制品在來源、潛在污染病毒的特性、生產(chǎn)工藝及臨床應用的給藥方式和適用人群等方面的不同，導致其病毒安全性風險大小存在差異。因此，生物制品的病毒安全性控制要求，應建立在風險評估的基礎上結合產(chǎn)品特點綜合考慮。
（二）全過程控制
生物制品病毒安全性控制應體現(xiàn)在生物制品質量控制的全過程。其基本要素包括對生產(chǎn)過程使用的相關物料（起始原材料、原材料和輔料）的來源控制、病毒污染篩查或處理，生產(chǎn)工藝對病毒的清除作用，以及對產(chǎn)品（包括中間產(chǎn)物和成品）病毒污染的檢測。
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生產(chǎn)工藝變更對病毒清除的影響應加以評估，根據(jù)影響程度，對病毒清除步驟進行必要的確認或再驗證。必要時還應通過上市后監(jiān)測追溯產(chǎn)品病毒安全性，保證生物制品全生命周期的病毒安全性控制。
?。ㄋ模┎煌悇e生物制品病毒安全性控制要點
1. 人血液制品
人血液制品起始原材料為健康人血漿，存在經(jīng)血傳播病毒的安全性風險，人血液制品的病毒安全性控制應包含生物制品病毒安全性控制的所有要素，重點應考慮人血漿來源的病毒風險控制和生產(chǎn)工藝過程的病毒清除能力，必要時應實施對上市產(chǎn)品病毒安全性的追溯。
2. 動物體液/組織來源制品
動物體液/組織來源制品的病毒污染最大風險來源于起始原材料。重點應考慮起始原材料的動物病毒特別是人畜共患病毒的風險控制，以及生產(chǎn)工藝過程的病毒清除能力，必要時應對產(chǎn)品進行病毒污染的檢測。
3. 疫苗
疫苗制品的病毒安全性控制以對起始原材料、原材料和輔料的病毒污染來源控制為主，主要包括病毒污染的檢測和篩查。采用非重組技術生產(chǎn)的滅活疫苗，其生產(chǎn)工藝中針對目標病毒的滅活處理和驗證應按具體品種的相關要求執(zhí)行；采用重組技術生產(chǎn)的疫苗還應符合重組治療性生物制品的相關要求。
4. 重組治療性生物制品
重組治療性生物制品的病毒安全性控制應在風險評估的基礎上，重點考慮對工程細胞基質、工程菌、原材料和輔料的病毒污染來源進行控制。采用動物細胞表達的重組治療性生物制品還應重點考慮生產(chǎn)工藝過程的病毒清除能力。
5. 基因治療產(chǎn)品
基因治療產(chǎn)品的病毒安全性控制應在風險評估的基礎上，重點考慮對細胞基質、菌毒種、原材料和輔料的病毒污染來源進行控制。采用病毒為載體的基因治療產(chǎn)品，還應建立與病毒載體特性及生產(chǎn)工藝特點相適應的病毒風險評估和控制要求，如對非復制型病毒載體生產(chǎn)工藝應關注產(chǎn)生復制型病毒的風險和控制，復制型病毒載體生產(chǎn)應關注產(chǎn)生野生型病毒的風險和控制，生產(chǎn)過程中使用輔助病毒的，應評估和驗證生產(chǎn)工藝對輔助病毒的清除能力。如可行，應評估病毒載體純化工藝對相應病毒的清除能力。
二、病毒安全性控制的具體要求
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1. 起始原材料
生物制品的起始原材料主要包括生產(chǎn)用細胞基質、菌毒種、血液制品生產(chǎn)用原料血漿和動物體液/組織，應分別符合 “生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質制備及質量控制” “生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質量控制” “血液制品生產(chǎn)用人血漿” “人用馬免疫血清制品總論” 及 “生物制品生產(chǎn)及檢定用實驗動物質量控制（通則 3601）” 的相關要求。
人血液制品生產(chǎn)用原料血漿病毒安全性控制，應重點考慮供血漿者的篩查、單份血漿和合并血漿的病毒檢測。
源自動物組織或體液的生物制品，如動物來源的免疫血清、體液或器官等，應控制動物的來源并實施檢疫/檢疫期管理，不得使用來自疫區(qū)的動物，保持動物的清潔衛(wèi)生，發(fā)現(xiàn)存在健康隱患的動物，應及時處理或予以淘汰。
2. 原材料及輔料
應符合 “生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質量控制” 的相關要求。應盡可能選擇無病毒安全性風險或低風險的原材料和輔料用于生物制品生產(chǎn)，如選擇采用重組技術生產(chǎn)的生物材料替代動物源性生物材料，或采用化學材料替代生物材料。
?。ǘ┥a(chǎn)過程控制
1. 產(chǎn)品生產(chǎn)工藝
生物制品生產(chǎn)過程包含的理化工藝步驟可能具有一定的病毒清除作用，通過工藝開發(fā)和驗證可證明生產(chǎn)工藝對于潛在病毒污染的整體清除作用。由于產(chǎn)品制備工藝通常會在工藝參數(shù)允許的范圍內變化，可能導致其病毒清除作用難以控制在恒定水平，因此，應明確影響病毒清除效果的關鍵工藝參數(shù)及控制范圍，并在此基礎上建立充分的產(chǎn)品制備工藝過程的控制策略。當產(chǎn)品制備工藝不足以達到有效清除病毒、控制產(chǎn)品病毒安全性的目的時，應增加特定的病毒清除工藝步驟。
2. 特定病毒清除工藝步驟
特定病毒清除工藝步驟是在生物制品生產(chǎn)過程中為去除/滅活潛在污染病毒而加入的，這些步驟可能不是產(chǎn)品制備或純化所必需的。
根據(jù)潛在污染病毒的特性，結合產(chǎn)品特性和生產(chǎn)工藝、病毒清除工藝的作用機制和清除能力的綜合評估，選擇適宜的病毒清除工藝（包括作用機制的選擇，以及單一或組合工藝步驟的選擇等）。病毒去除/滅活工藝效果應經(jīng)過驗證并符合相關要求。
對于特定的病毒清除工藝步驟，應明確影響病毒清除效果的關鍵工藝參數(shù)以及相應參數(shù)設定范圍對病毒清除效果的影響。某些特定的病毒清除工藝步驟可能會對生物制品活性成分產(chǎn)生影響，如活性成分的降解/聚合或結構改變等，因此應根據(jù)病毒清除工藝對產(chǎn)品質量的影響情況進行綜合評估，選擇適宜的病毒清除方法，明確病毒清除工藝步驟涉及的中間產(chǎn)物的關鍵參數(shù)，如蛋白質濃度、pH 值等，并評估病毒清除步驟對產(chǎn)品關鍵質量屬性的影響。
（三）產(chǎn)品病毒污染的檢測
1. 病毒污染檢測設置的原則
病毒污染檢測結果的準確性和可靠性與污染來源、污染病毒的特性、生產(chǎn)工藝步驟等密切相關，某些情況下因未加工粗品（未經(jīng)任何純化工藝步驟處理的初加工合并物，如擴增或發(fā)酵產(chǎn)物，或經(jīng)過一次或多次回收/分離提取后集中起來的生物材料，如混合血漿、混合的抗血清等）可能具有細胞毒性作用，或污染病毒隨著生產(chǎn)過程中的某階段中間產(chǎn)物的部分加工處理而失去活性，從而影響病毒檢測結果，因此，應綜合上述因素確定對生產(chǎn)過程中最適階段的中間產(chǎn)物或成品進行取樣和檢測，以及應檢測病毒的種類、頻率和方法。
通常，檢出外源病毒污染的中間產(chǎn)物不能用于進一步加工制備，成品不能放行，同時應查找并確認污染來源，采取適當?shù)姆揽卮胧?/p>
2. 病毒污染檢測方法的選擇
應結合品種特點和具體生產(chǎn)情況的綜合分析，設計并選擇適宜的方法對潛在污染病毒進行檢測，如細胞培養(yǎng)法、核酸擴增技術等。為提高病毒檢岀率，應盡可能采用先進的技術和方法用于病毒污染的檢測。病毒檢測陰性不能完全證明無病毒污染存在，應排除因取樣量不足、病毒含量低于檢測方法的靈敏度，或檢測方法不適用等導致病毒檢測結果陰性的情況。
?。ㄋ模┎《厩宄に囼炞C
病毒清除工藝驗證（采用指示病毒以評價生產(chǎn)工藝過程病毒去除/滅活能力的驗證）的目的是證明實際生產(chǎn)過程對病毒去除/滅活的有效性，并對病毒的整體降低水平作出定量評估。
病毒清除工藝驗證通常是在非生產(chǎn)現(xiàn)場的特定實驗室進行，在縮小規(guī)模的情況下，通過將一定量的指示病毒（在病毒去除/滅活工藝驗證研究中使用的用于顯示工藝處理效果的感染性活病毒）加入起始原材料或生產(chǎn)過程某階段的中間產(chǎn)物中，模擬實際生產(chǎn)工藝參數(shù)及控制條件下的處理過程，然后取樣測定經(jīng)處理后產(chǎn)品中的殘留指示病毒，以證明經(jīng)過該特定工藝處理后指示病毒的去除或滅活已達到相關規(guī)定的要求。
1. 一般要求
（1）指示病毒的選擇
應盡可能選擇對人類沒有致病力、與潛在污染病毒相似且易于體外培養(yǎng)、適合具體產(chǎn)品特性及工藝特點、對驗證工藝具有耐受性的病毒作為指示病毒，指示病毒可分為“相關”病毒（用于生產(chǎn)過程中評價病毒去除情況的病毒，可以是已鑒定過的病毒或是與已知病毒種類相同的病毒，或是生產(chǎn)過程中使用的任何易污染細胞培養(yǎng)物或污染其他生產(chǎn)用材料、試劑的病毒）、特異 “模型” 病毒［與已知病毒或可疑病毒密切相關（同種或同屬）的病毒，并與所觀察到的或可疑病毒具有類似理化特性的病毒］和非特異 “模型” 病毒（用來為生產(chǎn)工藝去除病毒能力定性的病毒，其目的是對生產(chǎn)過程去除/滅活病毒的總體能力進行定性，即確定純化工藝的能力）三類，應優(yōu)先選擇與潛在污染病毒密切相關的病毒，如相關病毒不能獲取或不適于體外培養(yǎng)（如不能離體培養(yǎng)到足夠高的滴度），可采用特異 “模型” 病毒代替；評價病毒清除的總能力時，應選擇具有不同特性的非特異性 “模型” 病毒，包括 DNA/RNA、有/無包膜、顆粒大小、尤其對物理/化學處理明顯耐受的病毒等。此外，還應考慮指示病毒的實驗毒株與自然毒株及其他毒株之間可能存在的差異，在其他特性相同的前提下應優(yōu)先選擇抵抗力強的毒株（病毒清除工藝驗證常用指示病毒示例及相關屬性見表 1）。
（2）常用特定病毒清除工藝
病毒清除工藝的清除能力可能具有病毒種屬特異性。因此需要在風險評估的基礎上，結合可能污染病毒及產(chǎn)品的特性進行綜合考量，選擇合適的特定病毒清除工藝。常用的特定病毒清除工藝包括巴氏消毒法、干熱法、有機溶劑/去污劑（ S/D ）處理法、膜過濾法、低 pH 孵育法、色譜法等。
?。?）驗證方案的設計
?、俨《厩宄炞C研究是在縮小規(guī)模的體系中進行，其每個因素應盡可能反映實際生產(chǎn)過程中的情況，并闡明其合理性。例如色譜工藝步驟的柱床高度、線性流速、流速/柱床體積比、緩沖液、填料類型、pH、溫度、蛋白質濃度、鹽濃度及目標產(chǎn)品都應代表規(guī)模生產(chǎn)水平，洗脫曲線應具有類似性。此外，由于色譜柱對病毒的清除能力可能會隨著色譜柱重復使用而發(fā)生變化，因此，應評估多次使用后病毒清除的穩(wěn)定性。對于其他工藝步驟，應使用類似的理念。驗證工藝和實際生產(chǎn)情況的差異是難以避免的，應分析這種差異對驗證結果的影響。
?、谌缟a(chǎn)工藝中包含兩步或兩步以上病毒清除工藝步驟，應分別進行病毒清除效果驗證，以確定單個生產(chǎn)工藝步驟的清除作用和多個生產(chǎn)工藝步驟的綜合清除作用。
?、蹜鞔_病毒清除的機制，并依據(jù)病毒特性選擇適宜機制的病毒清除工藝。用于病毒清除驗證的指示病毒的初始滴度應盡可能高，使指示病毒以較小的體積加入待測產(chǎn)品中，以避免加入病毒引起稀釋效應或者改變產(chǎn)品的性質。在滅活工藝中，通過病毒滅活動力學（包括病毒滅活速率和滅活曲線）研究結果的評估，可獲得確切的病毒滅活效應。
?、茯炞C樣品的各成分含量和理化特性應與規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)品盡可能一致，在此基礎上評估影響病毒清除效果的工藝參數(shù)變化范圍，以及清除工藝的穩(wěn)定性。確定對清除效果影響最大的條件/最差條件進行驗證。
（4）驗證影響因素的考慮
?、衮炞C用指示病毒的制備 制備驗證所用病毒應避免病毒聚集，高滴度病毒易出現(xiàn)聚集，可能影響工藝對病毒的去除和（或）滅活效果，從而使驗證結果與實際生產(chǎn)情況不符，導致對實際病毒清除工藝效果的誤判。
?、谌舆^程 驗證過程中每步取出的樣品應盡快并盡可能直接進行病毒測定。如果樣品必須做進一步處理（如超離心、透析或保存、除去抑制劑或毒性物質等），或不同時間取出的樣品要放置一定時間等待同一時間點進行測定，這種情況下應進行平行對照分析，以確定樣品在進行病毒滴度檢測前經(jīng)歷的上述處理過程不會使病毒失去感染性，從而影響病毒滴度的檢測結果。
?、鄹蓴_因素 應評估緩沖液和產(chǎn)品自身對指示病毒的毒性作用或對病毒滴度檢測方法的干擾作用，必要時采取適當措施，減少對病毒清除工藝效果的評估產(chǎn)生影響。
2. 用于病毒清除研究的檢測方法
應盡可能選擇靈敏度高的病毒檢測方法，以確保對滅活效果的準確判定。用于病毒清除研究的檢測方法應經(jīng)評估，評估包括靈敏度、特異性、重復性、緩沖液/基質對病毒感染力的干擾、可能影響選用指示病毒對細胞感染能力的產(chǎn)品及緩沖液的細胞毒性分析等。
常用病毒檢測方法可采用病毒含量或滴度檢查（包括蝕斑形成試驗和細胞病變法）或定量病毒核酸檢測相關技術。
3. 病毒清除效果的評估
通常采用指示病毒的清除下降因子評估病毒清除效果。此外，由于病毒滅活過程通常不是簡單的一級反應，一般是起始反應速率快，其后變慢，在不同的時間點取樣檢測病毒感染性并建立病毒滅活動力曲線可更好地顯示病毒滅活的效果。
病毒清除驗證是通過跟蹤檢測指示病毒感染性/病毒量的變化進行評估的，應選擇能夠準確反映指示病毒信息的關鍵點進行病毒清除驗證的設計、實施及分析，從而達到可靠地評估清除步驟去除/滅活病毒能力的目的。
?。?）病毒清除下降因子的評估
病毒清除下降因子（指經(jīng)過生產(chǎn)工藝步驟處理后，指示病毒感染量被去除/滅活的程度）用生產(chǎn)過程病毒清除步驟前后的病毒量（滴度）減少比例的常用對數(shù)來表示。整個生產(chǎn)工藝的總病毒清除下降因子一般為單一清除步驟的病毒清除下降因子之和。制品的整體工藝病毒清除下降因子通常應遠大于最終產(chǎn)品的單次使用量的起始原材料中存在的假定病毒量。
（2）病毒清除下降因子的計算
病毒清除下降因子可以通過以下公式計算。
式中 R為病毒清除下降因子；
V1為起始樣品體積；
T1為起始樣品的病毒滴度；
V2為最終樣品體積；
T2為最終樣品的病毒滴度。
在計算病毒清除下降因子時，以指示病毒與樣品按一定比例混勻后零點取樣測得的基礎滴度為起始樣品的病毒滴度；如上述情況不適用，則按加標病毒溶液的病毒滴度為起始病毒滴度進行計算。
?。?）評估結果的說明
病毒清除下降因子（log10）≥ 4 logs，表示該步驟去除/滅活病毒有效；如因檢測方法導致病毒清除下降因子＜4 logs時，應盲傳三代，如無病毒檢出，可認定是有效的病毒清除方法。一般情況下，病毒清除下降因子≤1 log 的，不應作為病毒清除步驟。
需要強調的是，病毒清除下降因子對數(shù)減少值不能作為病毒清除步驟有效性的唯一或絕對指標。對病毒清除工藝有效性的評估，應綜合考慮相關因素，如指示病毒的適合性、病毒清除研究的設計、有效步驟或整體工藝病毒清除下降因子、滅活速率、清除工藝的影響因素、病毒檢測方法的靈敏度等。
4. 統(tǒng)計分析
病毒清除研究中，應采用適宜的統(tǒng)計處理方法進行分析，特別是有關病毒含量的正確估算，以支持得出的結論。
?。ㄎ澹┥a(chǎn)工藝變更對病毒清除的影響
生產(chǎn)工藝變更可能影響前期已確認的病毒安全性評價結果，應評估這種變化對病毒清除的直接和間接影響，根據(jù)影響程度，對病毒清除步驟進行必要的確認或再驗證。
三、上市產(chǎn)品的病毒安全性追蹤
產(chǎn)品上市后的追蹤觀察，是確認生物制品病毒安全性的直接證明。應定期對產(chǎn)品潛在病毒的污染進行回顧性追溯，采用適宜方法監(jiān)測針對產(chǎn)品的可能污染的病毒，實現(xiàn)上市后產(chǎn)品病毒安全的可追溯。隨著新的檢測技術的應用以及上市產(chǎn)品使用范圍進一步擴大，如發(fā)現(xiàn)新的病毒，應及時進行分析和評估，并制定新的產(chǎn)品病毒安全性控制策略。
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